黃藤素對(duì)LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抗炎作用及機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜炎是機(jī)體無(wú)法自行清除入侵子宮內(nèi)膜的病原菌進(jìn)而導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，對(duì)當(dāng)今奶牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展有重大危害。目前抗生素、微生態(tài)制劑和中草藥等被廣泛用于治療子宮內(nèi)膜炎等子宮相關(guān)性疾病。近些年，中草藥對(duì)子宮內(nèi)膜炎等疾病的臨床治療成為了研究熱點(diǎn)，主要是因?yàn)槠洳粌H能夠促進(jìn)血液循環(huán)，促進(jìn)子宮收縮，提升機(jī)體抗病能力，還能夠抗菌消炎，而且殘留少、毒副作用弱。黃藤素作為一種天然的植物藥，具有抗菌、消炎、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等多種藥理作用。臨床上，黃

2、藤素被廣泛用于治療人的慢性子宮內(nèi)膜炎、婦科炎癥、盆腔炎、胃腸炎、骨膜炎等疾病，但其在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用研究卻很少，應(yīng)用其治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的子宮內(nèi)膜炎疾病的報(bào)道更少。為了研究黃藤素對(duì)子宮內(nèi)膜炎的抗炎作用及其可能的抗炎機(jī)制，開展了以下實(shí)驗(yàn)。
　　1.黃藤素對(duì)gEECs毒性作用的檢測(cè)
　　黃藤素作用于山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(gEECs)后，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況;瑞氏-姬姆薩染色法觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并通過(guò)測(cè)定乳酸脫氫酶(

3、LDH)的含量檢測(cè)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性。結(jié)果顯示，黃藤素對(duì)山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的安全劑量為≤250μg/mL，該劑量范圍內(nèi)藥物對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)顯著性影響;大于該劑量的黃藤素可顯著性提高子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的膜通透性，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。黃藤素的濃度在0-100μg/mL時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而且增殖狀態(tài)良好，因此選擇低、中、高濃度分別為20、40和80μg/mL的黃藤素用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.黃藤素對(duì)LPS誘導(dǎo)的gEECs炎

4、癥反應(yīng)中相關(guān)細(xì)胞因子的影響
　　利用5μg/mL的LPS作用于gEECs12 h建立炎癥模型，然后用20，40和80μg/mL濃度的黃藤素對(duì)炎癥模型治療4、8、12、24、36h，分別收集正常細(xì)胞組、LPS炎癥模型組和藥物處理組的細(xì)胞上清液，ELISA實(shí)驗(yàn)法測(cè)定各組細(xì)胞因子的含量，化學(xué)法檢測(cè)NO的含量。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中各細(xì)胞因子的分泌量顯著增多(P＜0.05)。黃藤素一方面可以上調(diào)抗炎因子IL-10的分

5、泌，另一方面又可以下調(diào)促炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6和炎性介質(zhì)NO的分泌量，調(diào)控炎癥反應(yīng)發(fā)生的強(qiáng)弱。而且，黃藤素還可以抑制MMP-2和MMP-9的分泌。說(shuō)明，黃藤素不僅對(duì)LPS誘導(dǎo)的山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞建立的炎癥模型具有抗炎作用，還可以對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性起到保護(hù)作用。
　　3.黃藤素對(duì)LPS誘導(dǎo)的gEECs炎癥模型中TLR4信號(hào)通路的影響
　　利用5μg/mL的LPS作用于gEECs12 h建立炎癥模型，

6、濃度分別為20，40和80μg/mL的黃藤素對(duì)炎癥模型治療8h，然后用RT-PCR法對(duì)TLR4信號(hào)通路上各蛋白的基因水平進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，LPS炎癥模型組中IL-1β、TLR4、CD14、TRIF和NF-κBp65mRNA的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而且黃藤素能顯著抑制這些蛋白mRNA的表達(dá)水平，而MyD88的基因表達(dá)量沒有任何變化(P＞0.05）。WB檢測(cè)結(jié)果顯示，黃藤素作用下，炎性細(xì)胞中NF-κBp65的蛋白表達(dá)水