異甘草素對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肝炎是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，病毒性肝炎是肝炎中的主要類型，在我國(guó)尤其是HBV感染引起的乙型肝炎。這類疾病的發(fā)生和發(fā)展與病毒、宿主遺傳易感性和機(jī)體免疫力受損等多種因素相關(guān)。這些因素不僅引起急慢性肝炎，而且與肝纖維化、肝衰竭、肝癌等密切相關(guān)。趨化因子和細(xì)胞因子之間的相互作用是促進(jìn)肝臟炎癥進(jìn)展的一個(gè)重要決定因素。
　　γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)在抵御病毒感染中起著關(guān)鍵的作用，主要介導(dǎo)Th1型炎癥

2、反應(yīng)，可誘導(dǎo)趨化因子（C-X-C基序）配體(Chemokine(C-X-C motif) ligand)(CXCL9，CXCL10，CXCL11)和細(xì)胞因子，如白介素(Interleukin，IL)-6，腫瘤壞死因子(Tumour necrosis factor, TNF)-α等產(chǎn)生。這些炎性因子之間相互影響可以形成一個(gè)炎性惡性循環(huán)，是導(dǎo)致肝內(nèi)持續(xù)炎癥反應(yīng)的主要機(jī)制。CXCL9、CXCL10和CXCL11被統(tǒng)稱為IFN-γ誘導(dǎo)基因，均屬

3、于趨化因子受體3(C-X-C motif chemokine receptor3，CXCR3)配體，其中CXCL10在肝病中研究最為廣泛，它又被稱為IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10(IFN-gamma inducible protein10，IP-10)。多項(xiàng)研究表明，IFN-γ誘導(dǎo)基因具有多種生物學(xué)效應(yīng)，與其受體CXCR3結(jié)合有助于病毒清除的同時(shí)，也通過(guò)募集炎性效應(yīng)細(xì)胞分泌各種炎癥介質(zhì)。IFN-γ誘導(dǎo)基因在多種病毒性肝炎中表達(dá)水平異常增高，進(jìn)一

4、步加重組織損傷，在慢性肝炎的發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后等都起著重要的作用。抑制這些炎性因子可改善各種肝炎引起的不良后果。而CXCR3及其配體成為治療肝炎新的治療靶點(diǎn)。
　　異甘草素(4，2'，4'-trihydroxychalcone，Isoliquiritigenin，ISL)是一種異黃酮類化合物。它是甘草抗炎的活性成分之一，在甘草中含量極少卻具有廣泛的藥理活性，如抗氧化、抗炎、抗血小板聚集和抗癌等。其中，ISL的抗炎作用是近年來(lái)研

5、究的熱點(diǎn)。本研究旨在探索ISL抗肝臟炎癥的作用及其在肝細(xì)胞內(nèi)可能的抗炎機(jī)制。
　　方法：
　　1、檢測(cè)不同病情程度的乙型肝炎患者血清中的CXCL10水平。
　　研究人群被分為以下幾組:乙肝病毒攜帶者、輕度慢性乙型肝炎患者、中度慢性乙型肝炎患者、重度慢性乙型肝炎患者和健康對(duì)照組，每組各21例。用ELISA法檢測(cè)各組血清中CXCL10的表達(dá)水平。
　　2、構(gòu)建IFN-γ誘導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型及分析ISL對(duì)炎性因子

6、的影響。
　　HepG2和L02細(xì)胞暴露于不同濃度的IFN-γ和/或ISL作用不同時(shí)間。用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK8)法進(jìn)行細(xì)胞活力評(píng)估;再分別用qRT-PCR和ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞上清中趨化因子CXCL9，CXCL10，CXCL11或（和）IL-6的mRNA水平或者蛋白水平。
　　3、分析ISL影響IFN-γ誘導(dǎo)的肝細(xì)胞炎性因子高表達(dá)的分子機(jī)制
　　將HepG2和L02細(xì)胞暴露于IFN-γ，不同濃度的ISL，以

7、及IFN-γ聯(lián)合不同濃度ISL中，用免疫印跡法Western Blot(WB)檢測(cè)IFN-γ誘導(dǎo)的信號(hào)通路或ISL作用相關(guān)信號(hào)通路Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子1(Signaltransducer and activator of transcription1,STAT1)，核因子-κB(Nuclear factor kappaB，NF-κB)，干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regu

8、latory factor3，IRF3)/髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor88，MyD88)，促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)，磷酸肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB/Akt)的磷酸化和（或）總蛋白水平。
　　結(jié)果：<

9、br>　　1、CXCL10表達(dá)水平與乙型肝炎患者病情嚴(yán)重程度有正相關(guān)性
　　與健康對(duì)照組相比，乙型肝炎患者血清中CXCL10水平均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在慢性重度乙型肝炎患者血清中CXCL10表達(dá)水平最高，提示與乙型肝炎嚴(yán)重程度有相關(guān)性。
　　2、在HepG2和L02的細(xì)胞中，用IFN-γ處理后CXCL9，CXCL10，CXCL11和IL-6的表達(dá)水平增高，這種高表達(dá)可被ISL抑制，呈劑量依賴性（IFN

10、-γ+5μg/mlISL組vs IFN-γ誘導(dǎo)組，P＜0.05）。當(dāng)ISL處理劑量達(dá)到5μg/ml時(shí)，與IFN-γ誘導(dǎo)組相比， ISL對(duì)IL-6抑制水平小于50％，而對(duì)三種趨化因子抑制水平均大于50％。說(shuō)明ISL對(duì)高表達(dá)CXCL9-11的抑制效果比ISL對(duì)IL-6的抑制效果更顯著。
　　3、ISL預(yù)處理可抑制JAK1/STAT1、IRF3/MyD88、ERK/MAPK、JNK/MAPK和PI3K/Akt信號(hào)途徑的激活，且呈劑量依賴