IFN-γ介導(dǎo)的HMGB1對小鼠系膜細(xì)胞的促增殖作用及其可能機(jī)制.pdf

1、目的：本實驗以小鼠系膜細(xì)胞MMC為研究對象，以IFN-γ為刺激物，通過檢測小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平，探討HMGB1的促增殖作用；同時通過對HMGB1刺激后小鼠系膜細(xì)胞中AKT及p-AKT、蛋白表達(dá)水平的檢測探討HMGB1促增殖作用及其作用機(jī)制。
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種常見的自發(fā)性全身免疫性疾病，其病變侵犯皮膚及多個臟器，約有三分之二的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者伴有狼瘡性腎

2、炎(LN)的發(fā)生，腎臟的損傷程度是判斷其預(yù)后的主要指標(biāo)，同時LN也是其主要的致死原因之一，因此LN的治療尤為重要。但是關(guān)于LN的發(fā)病原因目前研究的并不是非常清楚，專家認(rèn)為其發(fā)生與免疫系統(tǒng)功能異常、各種細(xì)胞因子分泌及表達(dá)紊亂有關(guān)。高遷移率族蛋白1(high mobility group protein box1，HMGB1)最初作為一種核蛋白被發(fā)現(xiàn)，其廣泛的參與了細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，復(fù)制等各個環(huán)節(jié)，可由單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，受損細(xì)胞及壞死細(xì)胞等釋放

3、至胞外，促使炎性細(xì)胞活化并且刺激炎性因子的釋放，從而介導(dǎo)并放大炎癥反應(yīng)，發(fā)揮其炎性效應(yīng)；同時HMGB1做為一種免疫佐劑，是危險信號相關(guān)模式分子家族中的一員，可被表達(dá)其受體的免疫細(xì)胞識別，從而啟動機(jī)體免疫應(yīng)答，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。研究表明，HMGB1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病患者的體內(nèi)均存在不同程度的高表達(dá)；HMGB1的促增殖作用也得到越來越多的重視。我們的前期實驗檢測了HMGB1在狼瘡性腎炎患者外周血及狼瘡

4、腎炎的小鼠模型腎組織中的蛋白及mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果提示HMGB1表達(dá)水平呈明顯增高。我們通過在體外對小鼠系膜細(xì)胞的培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，在IFN-γ的介導(dǎo)下，HMGB1能夠通過某種信號途徑，作用于CyclinD1/CDK4/p16細(xì)胞周期調(diào)節(jié)系統(tǒng)，促使小鼠系膜細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞進(jìn)入新的細(xì)胞周期，從而介導(dǎo)了其促增殖作用。但其作用機(jī)制尚未得到證實。因此，我們開展了此次實驗，以IFN-γ為刺激物，通過檢測小鼠系膜細(xì)胞的增殖情況，

5、探討HMGB1的促增殖作用；同時通過對HMGB1刺激后小鼠系膜細(xì)胞中AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平的檢測，探討HMGB1促增殖作用的信號途徑。
　　方法：選取小鼠系膜細(xì)胞MMC為研究對象，同時設(shè)立正常對照組及10μg/ml IFN-γ刺激組，分別培養(yǎng)2，4，8和12小時，收集不同時間點(diǎn)細(xì)胞，以BRDU方法檢測小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平。選取小鼠系膜細(xì)胞MMC為研究對象，同時設(shè)立正常對照組、IFN-γ刺激組、IFN-γ刺激+空質(zhì)粒組和I

6、FN-γ刺激+pYr-3.1-shHMGB1組，以Western Blot和RT-PCR檢測pYr-3.1-shHMGB1的沉默效果，同時通過BRDU方法檢測小鼠系膜細(xì)胞的增殖情況。選取小鼠系膜細(xì)胞MMC為研究對象，同時設(shè)立正常對照組，以0.05mg/LHMGB1刺激小鼠系膜細(xì)胞，分別培養(yǎng)30min，45min，1h，2h，4h，8h和12h，通過Western blot和RT-PCR檢測AKT和p-AKT蛋白的表達(dá)情況。選取小鼠系膜細(xì)

7、胞MMC為研究對象，同時設(shè)立正常對照組、HMGB1刺激組、HMGB1刺激+空質(zhì)粒組和HMGB1刺激+pYr-3.1-shAKT組，以Western Blot和RT-PCR檢測pYr-3.1-shAKT的沉默效果，通過BRDU方法檢測小鼠系膜細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果：
　　1 IFN-γ上調(diào)小鼠系膜細(xì)胞增殖水平
　　以10μg/ml IFN-γ刺激小鼠系膜細(xì)胞，在刺激初期，小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平開始逐漸上升，至IFN-

8、γ作用4h，其增殖水平與正常對照組相比(0.96±0.02)提高明顯(1.76±0.05)，至IFN-γ作用8h，小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平最明顯(2.11±0.07)，而至作用12h后時其增殖水平逐漸回落。
　　2 RNA干擾技術(shù)能夠有效的下調(diào)小鼠系膜細(xì)胞中HMGB1和AKT的表達(dá)
　　以RNA干擾技術(shù)將低表達(dá)HMGB1及AKT的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)入小鼠系膜細(xì)胞。Western blot和RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后48h，小鼠系

9、膜細(xì)胞的HMGB1及AKT蛋白和mRNA表達(dá)水平與正常對照組相比均出現(xiàn)明顯降低。
　　3 HMGB1低表達(dá)的MMC中IFN-γ所介導(dǎo)的促增殖作用減弱
　　以IFN-γ為刺激物作用于轉(zhuǎn)染pYr-3.1-shHMGB1質(zhì)粒載體后的小鼠系膜細(xì)胞，結(jié)果提示，與IFN-γ刺激組和空質(zhì)粒組相比，HMGB1轉(zhuǎn)染組MMC的增殖水平明顯下降。
　　4 HMGB1上調(diào)小鼠系膜細(xì)胞中p-AKT蛋白的表達(dá)
　　Western blot結(jié)

10、果顯示，與正常對照組相比，HMGB1刺激小鼠系膜細(xì)胞初期即可出現(xiàn)p-AKT的表達(dá)增強(qiáng)，45min時最明顯，而對AKT蛋白的表達(dá)沒有影響。
　　5 AKT低表達(dá)的MMC中HMGB1所介導(dǎo)的促增殖作用減弱
　　以HMGB1為刺激物作用于轉(zhuǎn)染pYr-3.1-shAKT質(zhì)粒載體后的小鼠系膜細(xì)胞，結(jié)果提示，與正常對照組相比(0.976±0.08)，HMGB1刺激組MMC增殖水平明顯升高，而AKT低表達(dá)的小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平較單純HM