胞外HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化中的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種典型的自身免疫性疾病，其病變特征包括患者血清中出現(xiàn)高水平的針對(duì)自身核抗原產(chǎn)生的自身抗體。目前SLE的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，與多種因素有關(guān)。正常情況下，哺乳動(dòng)物DNA等核成分的免疫原性很弱，難以誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生，因而闡明自身DNA如何打破免疫耐受激活免疫系統(tǒng)是研究SLE發(fā)病機(jī)制的重點(diǎn)。
　　我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)與正常淋巴細(xì)胞來源的DNA(

2、UnALD-DNA)相比，用ConA活化的淋巴細(xì)胞來源的DNA(ALD-DNA)免疫同系BALB/c小鼠可以誘導(dǎo)抗dsDNA抗體的產(chǎn)生，高水平尿蛋白等SLE樣綜合征的發(fā)生;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):ALD-DNA可以有效活化免疫細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞，分泌大量炎性細(xì)胞因子，其中巨噬細(xì)胞是參與天然免疫的重要細(xì)胞，同時(shí)也是一類專職APC，在天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中均發(fā)揮著重要作用。但是ALD-DNA是如何被巨噬細(xì)胞識(shí)別，進(jìn)而活化巨噬細(xì)胞的，其

3、具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是高遷移率族蛋白(HMG)家族成員之一，因在聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中遷移率高而得名。它廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)以及釋放后具有炎癥介質(zhì)功能的核蛋白，是一種重要的與損傷相關(guān)的分子識(shí)別模式(damageassociated molecular patterns，DA

4、MPs)。靜息條件下，HMGB1存在于細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)機(jī)體受到一定刺激時(shí)，核內(nèi)的HMGB1可通過活化的免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞的主動(dòng)分泌和壞死細(xì)胞的被動(dòng)釋放轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1能夠結(jié)合多種核酸成分，進(jìn)而活化下游特異性核酸受體，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量炎性因子，在機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)核酸成分應(yīng)答的過程中可能扮演著重要角色。近年來有研究顯示HMGB1可以激活和趨化炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)大量細(xì)胞因子的分泌，被認(rèn)為是一種新型的炎性介質(zhì)，正引起國內(nèi)外

5、學(xué)者的廣泛關(guān)注。
　　前期我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化中扮演一定的角色，但是HMGB1是如何增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)ALD-DNA的識(shí)別，加重炎癥反應(yīng)，并且胞漿還是分泌到胞外的HMGB1對(duì)ALD-DNA識(shí)別、攝取及細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸?shù)扔绊懯窃鯓拥纳胁磺宄Ｔ诒狙芯恐?，我們重點(diǎn)探討了胞外還是胞內(nèi)的HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化中的作用機(jī)制，即HMGB1介導(dǎo)ALD-DNA刺激巨噬細(xì)胞活化的形式、位置及其機(jī)制

6、。這一研究不僅有助于我們更好地解釋HMGB1促進(jìn)ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的機(jī)制，而且為闡明SLE的發(fā)病機(jī)理提供了更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，有利于為SLE的防治策略尋找到新的靶點(diǎn)。
　　方法:首先用ALD-DNA刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞系后，用Western blot和ELISA的方法檢測(cè)細(xì)胞以及上清中HMGB1的表達(dá)情況。含有HMGB1-shRNA的慢病毒載體經(jīng)293 T細(xì)胞包裝病毒后，感染RAW264.7，Real-time和

7、Western blot評(píng)估HMGB1下調(diào)效率。ALD-DNA刺激上述HMGB1穩(wěn)定下調(diào)的巨噬細(xì)胞(HMGB1KD RAW264.7)及正常RAW264.7，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子表達(dá)水平，Real-time檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-6，IL-10，TNF-α mRNA表達(dá)情況，以評(píng)估HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化中的作用。用丙酮酸乙酯抑制HMGB1分泌出細(xì)胞外，HMGB1拮抗劑A盒肽和HMGB1特異性中和抗體等處理細(xì)胞后

8、，ELISA和Real-time的方法檢測(cè)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況，同時(shí)我們給予正常RAW264.7和HMGB1KD RAW264.7細(xì)胞外源HMGB1蛋白時(shí)，檢測(cè)了炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況，以評(píng)估胞外HMGB1在ALD-DNA刺激巨噬細(xì)胞活化中的作用。最后我們探討了HMGB1介導(dǎo)ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的機(jī)制，首先用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的方法HMGB1與ALD-DNA或UnALD-DNA的相互作用及結(jié)合親和力的差異;隨后通過流式細(xì)胞

9、術(shù)檢測(cè)了HMGB1對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬ALD-DNA或UnALD-DNA的影響;最后用激光共聚焦熒光顯微鏡觀測(cè)了HMGB1對(duì)ALD-DNA或UnALD-DNA進(jìn)入細(xì)胞后囊泡運(yùn)輸間的影響。
　　結(jié)果:ALD-DNA可以有效刺激巨噬細(xì)胞活化，HMGB1分泌顯著增加，并且呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴性;HMGB1-shRNA特異性下調(diào)HMGB1效果明顯，下調(diào)效率達(dá)到1/5，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);當(dāng)巨噬細(xì)胞中HMGB1下調(diào)后，其分泌HMGB1的能力減弱，同時(shí)A

10、LD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子、MHC-Ⅱ類分子表達(dá)下降，炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)顯著減少，巨噬細(xì)胞活化程度降低。丙酮酸乙酯阻止巨噬細(xì)胞受ALD-DNA刺激后HMGB1的分泌，HMGB1在胞質(zhì)中大量積累，細(xì)胞上清中炎性細(xì)胞因子的含量顯著減少;HMGB1拮抗劑A盒肽和HMGB1特異性中和抗體處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)ALD-DNA刺激巨噬細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子含量也顯著降低;同時(shí)給予正常RAW264.7以及HMGB1KD RAW264.7

11、外源HMGB1蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)HMGB1可以增強(qiáng)ALD-DNA刺激正常RAW264.7分泌更多的炎性細(xì)胞因子，并且ALD-DNA刺激HMGB1KD RAW264.7分泌炎性細(xì)胞因子的能力在加入外源HMGB1后得到一定程度的恢復(fù)。競(jìng)爭(zhēng)性間接ELISA的結(jié)果表明HMGB1可以與ALD-DNA和UnALD-DNA結(jié)合，但是與ALD-DNA的結(jié)合親和力顯著高于UnALD-DNA;HMGB1對(duì)巨噬細(xì)胞攝取不同DNA沒有顯著影響;激光共聚焦的結(jié)果顯示HM

12、GB1可以顯著增加ALD-DNA在內(nèi)體上的定位，并且加速了ALD-DNA在內(nèi)體上的募集。
　　結(jié)論:ALD-DNA可以有效刺激巨噬細(xì)胞分泌HMGB1，并且這一過程具有時(shí)間劑量依賴性。HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化中具有重要作用，且胞外HMGB1在其中扮演關(guān)鍵角色。HMGB1可以有效與ALD-DNA結(jié)合，加速和增加了其在巨噬細(xì)胞內(nèi)早期內(nèi)體上的募集，從而促進(jìn)了ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，介導(dǎo)SLE的病理發(fā)展。該研究進(jìn)一