PARP-1調(diào)控LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞HMGB1釋放的機(jī)制及意義研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 PARP-1對(duì) LPS誘導(dǎo)的HMGB1核漿移位和釋放的影響
　　目的:研究 LPS激活 RAW264.7細(xì)胞 PARP-1活性變化的時(shí)間規(guī)律,以及PARP-1對(duì) RAW264.7細(xì)胞內(nèi) HMGB1分泌的影響,探討 PARP-1在炎癥反應(yīng)中的作用。
　　方法:通過(guò) cell ELISA法測(cè)定 LPS刺激后 RAW264.7細(xì)胞內(nèi) PARP-1活性變化的時(shí)間規(guī)律;用LPS(1

2、00ng/ml)+DMSO、LPS+3-AB(10mM)刺激 RAW264.7細(xì)胞,通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞上清液和胞漿胞核內(nèi) HMGB1的變化;構(gòu)建 PARP-1 siRNA質(zhì)粒和對(duì)照的sc siRNA質(zhì)粒,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到 RAW264.7細(xì)胞中,用100ng/ml的LPS處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞上清液和胞漿胞核內(nèi) HMGB1的變化。
　　結(jié)果:LPS刺激 RAW264.7細(xì)胞后,PARP-1活性升高,刺激4小時(shí)后活性

3、達(dá)到高峰;在 LPS+DMSO刺激后4、8、16、24小時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1的含量增加,刺激后2、4、8小時(shí),細(xì)胞漿中HMGB1的含量增加,胞核內(nèi) HMGB1含量降低,加用3-AB刺激和轉(zhuǎn)染 PARP-1 siRNA沉默 PARP-1表達(dá)可以抑制上述反應(yīng)。
　　結(jié)論:LPS刺激 RAW264.7細(xì)胞后 PARP-1活性增加,抑制PARP-1的活性或沉默其表達(dá),可以減少 HMGB1向胞漿移位和向細(xì)胞外釋放。PARP-1參與了

4、LPS誘導(dǎo)的HMGB1核漿移位和釋放的調(diào)節(jié)。
　　第二部分 PARP-1通過(guò)促進(jìn) HMGB1乙?；閷?dǎo) LPS誘導(dǎo)的HMGB1核漿移位
　　目的:研究 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞 PARP-1對(duì) HMGB1乙?；潭鹊挠绊?以及PARP-1對(duì) RAW264.7細(xì)胞內(nèi)乙酰化酶和去乙?；富钚缘挠绊?探討 PARP-1在炎癥反應(yīng)中的作用。
　　方法:用3-AB抑制PARP-1活性或?qū)?PARP-1沉默后,通過(guò)免疫沉淀

5、法純化 HMGB1蛋白,然后用western blot的方法檢測(cè) HMGB1的乙?；揎?用比色法檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞內(nèi) HAT和HDAC活性。
　　結(jié)果:LPS刺激 RAW264.7細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi) HMGB1的乙?；皆黾?抑制PARP-1活性或沉默 PARP-1的表達(dá)降低胞內(nèi) HMGB1乙酰化水平,降低 HAT活性、提高 HDAC活性。
　　結(jié)論: PARP-1通過(guò)提高胞內(nèi) HAT活性促進(jìn) HMGB1的乙?；?介

6、導(dǎo) HMGB1核漿移位。
　　第三部分 HMGB1蛋白 NLS的PAR修飾位點(diǎn)突變對(duì)其核漿移位的影響
　　目的:研究 HMGB1蛋白 NLS的PAR修飾位點(diǎn)突變對(duì) HMGB1核漿移位的影響,探討 PARP-1在炎癥反應(yīng)中的作用。
　　方法:用3-AB抑制PARP-1活性或?qū)?PARP-1沉默后,通過(guò)免疫沉淀法純化 HMGB1蛋白,然后用western blot的方法檢測(cè) HMGB1的核糖基化,對(duì) HMGB1蛋白 NLS

7、的PAR修飾位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變,構(gòu)建 HMGB1-GFP融合蛋白,轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞,LPS激活細(xì)胞,用western blot的方法檢測(cè) LPS活化后胞漿和胞核內(nèi) HMGB1的表達(dá),熒光顯微鏡下直接觀察胞漿胞核內(nèi) HMGB1表達(dá);NLS的PAR修飾位點(diǎn)突變后用3-AB抑制PARP-1活性,用western blot的方法檢測(cè)胞漿和胞核內(nèi) HMGB1的表達(dá)。
　　結(jié)果:LPS刺激 RAW264.7細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi) HMGB1的核

8、糖基化水平增加,抑制PARP-1活性或沉默 PARP-1的表達(dá)降低胞內(nèi) HMGB1核糖基化水平,HMGB1的NLS序列的PAR修飾位點(diǎn)突變抑制HMGB1向胞漿移位,NLS的PAR修飾位點(diǎn)突變后,抑制PARP-1的活性對(duì) HMGB1核漿移位沒(méi)有影響。
　　結(jié)論:NLS的PAR修飾位點(diǎn)在 HMGB1核漿移位的調(diào)節(jié)中占主導(dǎo)地位。
　　第四部分 PARP-1對(duì) LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型小鼠的影響
　　目的:探討 PAPR-1對(duì)膿

9、毒癥小鼠血清 HMGB1含量以及對(duì)膿毒癥小鼠生存時(shí)間的影響。
　　方法:SPF級(jí)昆明雄性小鼠60只,隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(PBS組),溶劑對(duì)照組(LPS+DMSO組),3-AB干預(yù)組(LPS+3-AB組),AZD2281干預(yù)組(LPS+AZD2281組),每組15只。腹腔注射 LPS法制作小鼠膿毒癥模型。對(duì)照組腹腔注射 PBS,余下三組先在腹腔分別注射 DMSO、3-AB、AZD2281,30min后腹腔內(nèi)注射 LPS做膿毒癥模型

10、。完成后8h分別處死各組小鼠3只,心臟采血,離心后分離血清,行 western blot檢測(cè)血清中HMGB1含量,余下小鼠觀察120h,記錄死亡時(shí)間和數(shù)目。
　　結(jié)果:LPS刺激后小鼠血清中HMGB1的含量增加,LPS+3-AB組和LPS+AZD2281組在刺激后8h血清中HMGB1含量明顯低于 LPS+DMSO,差異有顯著性(P<0.05)。LPS致膿毒癥導(dǎo)致了明顯的致死效應(yīng),經(jīng)3-AB和AZD2281治療后顯著延長(zhǎng)了小鼠的生存