HTLV-1病毒Tax蛋白對T淋巴細胞HMGB1基因轉錄調(diào)控機制的研究.pdf

1、第一部分不同T淋巴細胞中人HMGB1 mRNA和蛋白的表達水平
　　目的:觀察HTLV-1+、Tax+和Tax-T淋巴細胞人HMGB1 mRNA和蛋白的表達水平,分析Tax蛋白是否影響HMGB1的表達。
　　方法:從Tax-T細胞(Jurkat和TaxN)、Tax+T細胞(TaxP)、HTLV-1+T細胞(MT-4、MT-2)提取總RNA和蛋白質(zhì),以及瞬時轉染pCMV-Tax表達載體及其突變型Tax M22、Tax M47至

2、Jurkat細胞,24h后提取總RNA和蛋白質(zhì)。然后通過逆轉錄實時PCR定量檢測HMGB1 mRNA表達水平,分析Tax蛋白對HMGB1 mRNA表達的影響;通過免疫印跡檢測HMGB1蛋白表達水平,分析Tax及其突變蛋白對HMGB1蛋白表達的影響。
　　結果:Tax+T細胞(TaxP)中HMGB1 mRNA和蛋白質(zhì)表達水平明顯高于Tax-T細胞(Jurkat、TaxN)。HTLV-1+T細胞(MT-2、MT-4)中的HMGB1 m

3、RNA表達水平略微低于HTLV-1-T細胞(TaxP、Jurkat),而HTLV-1-T細胞(Jurkat)和HTLV-1+T細胞(MT-2、MT-4)間HMGB1蛋白未表現(xiàn)出明顯的差異。瞬時轉染Tax及其突變型M22和M47至Jurkat細胞中,Tax及其M22、M47突變蛋白促進HMGB1 mRNA和蛋白的表達。
　　結論:HTLV-1病毒Tax蛋白可能與某種轉錄因子相互作用促進人HMGB1基因的表達,而HTLV-1病毒的其他

4、蛋白可能抑制HMGB1基因表達。了解不同T淋巴細胞中HMGB1基因表達情況,為進一步研究Tax蛋白如何影響人HMGB1基因調(diào)控奠定了基礎。
　　第二部分不同HMGB1熒光素酶報告基因及其Jurkat穩(wěn)定細胞株的構建
　　目的:構建不同高遷移率族蛋白B1(HMGB1)調(diào)控序列的熒光素酶報告基因及其穩(wěn)定表達的Jurkat細胞株,為研究Tax蛋白影響HMGB1的轉錄調(diào)控提供質(zhì)粒及細胞來源。
　　方法:設計多個3’-端固定的H

5、MGB1調(diào)控引物,以Jurkat細胞基因組DNA為模板,PCR擴增不同長度HMGB1調(diào)控基因(-83~+83、-383~+83、-688~+83、-975~+83、-1163~+83、-1327~+83、-1520~+83),均將其連入pMD18-T載體,并轉化宿主菌DH5a,氨芐青霉素篩選,陽性克隆并提取質(zhì)粒,經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定和DNA測序驗證,正確的陽性克隆經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ雙酶切后,連入p

6、GL3-neo-luc報告基因的KpnⅠ/HindⅢ位點之間,成功構建含不同HMGB1調(diào)控基因的熒光素酶報告基因pGL3-HMGB1-luc質(zhì)粒。同樣,-1520~+83HMGB1調(diào)控基因經(jīng)XhoⅠ/HindⅢ雙酶切后,連入pGL3-neo-luc報告基因的XhoⅠ/HindⅢ位點之間,又構建出含-504~+83HMGB1的pGL3-HMGB1-luc質(zhì)粒。轉染不同pGL3-HMGB1-luc和pGL3-neo-luc報告基因質(zhì)粒至Ju

7、rkat細胞,48h后加入終濃度600μg/ml的G418進行藥物加壓篩選20d,然后選取單個陽性克隆細胞,用300μg/ml繼續(xù)篩選2~3個月,熒光素酶活性驗證是否成功構建其穩(wěn)定表達的Jurkat細胞株。
　　結果:以Jurkat細胞基因組為模板,克隆擴增7個3’-端固定的HMGB1調(diào)控基因,成功構建了8種pGL3-HMGB1-luc報告基因,按HMGB1基因由短至長順序依次命名為pHLuc1~pHLuc8。轉染pHLuc1~p

8、HLuc8報告基因和pGL3-neo-luc至Jurkat細胞,經(jīng)G418藥物篩選,成功構建含有pHLuc1~pHLuc8或pGL3-neo-luc報告基因的Jurkat穩(wěn)定細胞株,并根據(jù)HMGB1調(diào)控基因有無及其由短至長順序,依次命名為HJ1~HJ8細胞和NEO細胞。
　　結論:成功構建HMGB1熒光素酶報告基因及其HJ穩(wěn)定細胞株,為找尋HMGB1啟動子區(qū)域,研究Tax蛋白影響HMGB1基因的調(diào)控機制和HMGB1在成人T淋巴細胞

9、白血病中的發(fā)病機制奠定基礎。
　　第三部分HTLV-1病毒Tax蛋白對人T淋巴細胞HMGB1基因轉錄調(diào)控的影響
　　目的:觀察不同T淋巴細胞中人HMGB1基因啟動子活性,探討Tax及其M22、M47突變蛋白對HMGB1基因轉錄調(diào)控的影響。
　　方法:不同pGL3-HMGB1-luc報告基因和pGL3-neo-luc(對照)同時瞬時轉染到THP1、Hela、Jurkat、TaxP、TaxN、MT-4、MT-2等不同種類細

10、胞中,以及不同pGL3-HMGB1-luc報告基因與pCMV-Tax或其突變型M22、M47(pCMV-Neo作為對照)瞬時共轉染到Jurkat細胞中,24h后檢測熒光素酶活性,觀察不同細胞中相對熒光素酶活性比率(HMGB1/neo)和Tax及其M22、M47突變蛋白對T淋巴細胞中HMGB1基因的轉錄調(diào)控情況(Tax/Neo)。Tax及其突變型TaxM22、TaxM47瞬時轉染到HJ穩(wěn)定細胞株(HJ1~HJ8),pCMV-Neo質(zhì)粒作為

11、對照,比較不同HJ細胞株中HMGB1的相對熒光素酶活性(Tax/Neo)。通過細胞接觸逆轉錄病毒轉染法,HTLV-1+的MT-2細胞(Hut-78細胞作為對照)分別與HJ穩(wěn)定細胞株(HJ1~HJ8)以1:4的比例進行共培養(yǎng),比較每種細胞株中HMGB1的相對熒光素酶活性[(MT-2)/(Hut-78)]。比較Tax蛋白對瞬時表達HMGB1基因和穩(wěn)定表達HMGB1基因的轉錄調(diào)控差異。觀察BAY11-7082/NF-κB抑制劑對Tax蛋白誘導

12、HMGB1基因轉錄的影響。
　　結果:HMGB1在不同種類細胞中的調(diào)控趨勢大致相似,均表現(xiàn)出587bp長度HMGB1(-504~+83)的啟動子活性最高。HTLV-1+T細胞(MT-4、MT-2)中HMGB1的轉錄活性略低于HTLV-1-T細胞(Jurkat、TaxP)。比較TaxN(Tax-)和TaxP(Tax+)細胞中HMGB1的轉錄活性發(fā)現(xiàn),Tax蛋白促進pHLuc6~pHLuc8質(zhì)粒中HMGB1基因的轉錄。不同pGL3-H

13、MGB1-luc報告基因與pCMV-Tax共轉染到Jurkat細胞也顯示,Tax蛋白對-975~+83HMGB1基因影響不明顯,但促進pHLuc6~pHLuc8報告基因中HMGB1的轉錄表達。隨著Tax劑量的增加,pHLuc6質(zhì)粒中HMGB1的轉錄活性明顯增強。Tax及其突變型Tax M22、Tax M47與pHLuc3或pHLuc6共轉染至Jurkat細胞發(fā)現(xiàn),Tax及其M22、M47突變蛋白對pHLuc3質(zhì)粒中HMGB1轉錄調(diào)控影響

14、不明顯,而促進pHLuc6質(zhì)粒中HMGB1基因的轉錄。BAY11-7082/NF-κB抑制劑不影響Tax蛋白調(diào)控HMGB1基因的轉錄。
　　結論:-504~-383可能是HMGB1轉錄激活的關鍵啟動子區(qū),Tax蛋白可能結合在HMGB1的-1163~-975區(qū)段誘導其轉錄,但不是通過NF-κB途徑進行的。
　　第四部分富集Tax蛋白的HMGB1基因生物信息學分析及Tax蛋白對其基因轉錄調(diào)控機制的研究
　　目的:探討Tax

15、蛋白影響人T淋巴細胞HMGB1轉錄調(diào)控的基因片段、順式作用元件和轉錄因子。
　　方法:TaxP細胞經(jīng)固定、超聲和染色體免疫共沉淀(ChIP)處理后獲得純化的DNA,通過特異性引物,實時定量PCR擴增中心位點于-1103和-797處的HMGB1基因,尋找Tax蛋白富集在HMGB1的基因部位。應用生物信息學初步分析HMGB1-1163~-975區(qū)段的反式作用因子結合位點,通過野生型pHLuc6分別對其順式作用元件實施缺失突變,構建不同

16、突變型pHLuc6報告基因。在Jurkat中瞬時共轉染pCMV-Tax和突變型pHLuc6(野生型pHLuc6作為對照),或pCMV-Tax(pCMV-Neo作為對照)和突變型pHLuc6,24h后檢測熒光素酶活性,比較Tax蛋白對野生型和突變型pHLuc6中HMGB1的轉錄調(diào)控差異,尋找Tax蛋白影響人T淋巴細胞HMGB1基因轉錄的關鍵轉錄因子。
　　結果:ChIP純化后的樣本經(jīng)實時定量PCR擴增后,我們發(fā)現(xiàn)Tax蛋白在HMGB

17、1-1103基因(-1163~-1043)的富集信號明顯強于-797基因(-848~-746)的信號。即Tax蛋白主要富集在HMGB1的-1163~-975區(qū)段。生物信息學分析獲知,HMGB1-1163~-975區(qū)段有6種反式作用因子(AML-1a、AP-1、CdxA、USF、v-Myb和C/EBP)。使用野生型pHLuc6,分別針對每種轉錄因子的順式作用元件進行缺失突變,重新成功構建分別針對上述6種轉錄因子的突變型pHLuc6,依次命

18、名為mLuc6-AM、mLuc6-AP、mLuc6-Cd、mLuc6-U、mLuc6-M、mLuc6-C。瞬時共轉染pCMV-Tax和野生型pHLuc6或其突變型pHLuc6至Jurkat細胞后,發(fā)現(xiàn)突變型mLuc6-C中HMGB1的轉錄活性低至野生型pHLuc6的52％,并且在Jurkat細胞中Tax蛋白不影響mLuc6-C中HMGB1基因的調(diào)控表達。
　　結論:Tax蛋白富集在HMGB1的-1163~-975區(qū)段,可能通過轉錄