SAHA對T淋巴細(xì)胞功能的調(diào)控作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACI）是一類在染色質(zhì)水平調(diào)控基因表達(dá)的化合物，其所調(diào)控的基因與細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)。HDACI對眾多實(shí)體器官和血液系統(tǒng)腫瘤中具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，因此圍繞HDACI的研究主要集中于腫瘤領(lǐng)域。新近研究發(fā)現(xiàn)，HDACI 具備改善自身免疫性疾病模型癥狀，調(diào)控固有免疫功能以及抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)等一系列免疫調(diào)節(jié)活性。T淋巴細(xì)胞作為免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，在炎癥免疫性疾病和移

2、植免疫中發(fā)揮重要作用。然而HDACI對T淋巴細(xì)胞功能的調(diào)控作用和機(jī)制及其對移植排斥反應(yīng)的影響少有報(bào)道，其分子機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。我們通過設(shè)計(jì)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對T淋巴細(xì)胞增殖、活化和分化功能，基因表達(dá)調(diào)控和移植排斥反應(yīng)的影響，以探討HDACI在體外和體內(nèi)對T淋巴細(xì)胞的調(diào)控作用及分子機(jī)制。
　　 研究方法：（1）MACS 法體外分選小鼠脾臟來源CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，通過ConA 或培養(yǎng)板包

3、被的抗CD3/CD28 活化，并加入不同濃度SAHA 干預(yù)，3 H-TdR法檢測細(xì)胞增殖，F(xiàn)CM 檢測T細(xì)胞活化標(biāo)志分子及細(xì)胞凋亡情況，熒光定量PCR 檢測促炎細(xì)胞因子表達(dá)，Western-blot分析NF-κ B、NFAT等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化。(2)CD4+T細(xì)胞體外分選及活化同前，流式及熒光定量PCR 檢測Foxp3表達(dá)，分析SAHA對Treg分化的影響；MACS 法分選Treg和Teff細(xì)胞，分別活化并給予SAHA干預(yù)，熒光定量P

4、CR 檢測FOXP3表達(dá)，分析SAHA對Treg 體外擴(kuò)增，Teff 轉(zhuǎn)化的作用；CFSE 標(biāo)記的Teff與Treg 按照不同比例混合并活化，流式檢測增殖情況以分析SAHA對Treg 抑制功能的影響，并探討其分子機(jī)制。（3）體外誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th17分化，并加入不同濃度SAHA 干預(yù)，流式檢測IL-17A蛋白表達(dá)，熒光定量PCR檢測Th17相關(guān)基因表達(dá)變化，分析SAHA 調(diào)控Th17分化的分子機(jī)制。（4）構(gòu)建小鼠頸部異位心臟移植模

5、型（BALB/C→C57），觀察單獨(dú)應(yīng)用SAHA及聯(lián)合雷帕霉素（RPM）對移植物存活期的影響，取心臟移植物進(jìn)行病理分析，熒光定量檢測移植物內(nèi)炎性因子表達(dá)；移植后第7天流式檢測胸腺、脾臟、淋巴結(jié)中Treg的比例；過繼轉(zhuǎn)移研究SAHA在體內(nèi)對Teff的轉(zhuǎn)化作用；流式檢測SAHA對Treg 抑制功能的影響；探討SAHA對移植排斥反應(yīng)的調(diào)控作用與分子機(jī)制。（5）檢測SAHA 處理組和DMSO 處理組小鼠脾臟來源Treg細(xì)胞活化前后HDACs表達(dá)

6、情況，篩選調(diào)控Treg細(xì)胞分化的關(guān)鍵HDACs，構(gòu)建相應(yīng)siRNA 轉(zhuǎn)染JurkaT細(xì)胞，熒光定量PCR 檢測Treg相關(guān)基因表達(dá)，驗(yàn)證HDACs對Treg細(xì)胞分化的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果：（1）SAHA對T淋巴細(xì)胞增殖、活化和分化的影響：SAHA呈時間及劑量依賴性的抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞增殖；高濃度SAHA 顯著抑制CD25和NF-κ B表達(dá)，而CD69在活化后2h，6h和12h 均無顯著改變，提示SAHA 影響T細(xì)

7、胞中后期活化；SAHA 阻斷IL-2、IFN-γ、IL-12、TNF-α、和IL-10等促炎細(xì)胞因子表達(dá)；SAHA呈時間及劑量依賴性的促進(jìn)T細(xì)胞凋亡。同時顯著抑制體外誘導(dǎo)的Th17分化，提示高濃度SAHA 可通過干預(yù)T淋巴細(xì)胞活化和眾多促炎基因表達(dá)發(fā)揮免疫抑制作用。（2）SAHA在體外對Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)作用：隨著SAHA濃度的增加，CD4+Foxp3+T細(xì)胞所占的比例顯著降低，高濃度SAHA 顯著下調(diào)Foxp3基因表達(dá)，而低濃度SAH

8、A （0.1μM）輕度增加了Treg的比例，但沒有上調(diào)FOXP3表達(dá)，流式檢測顯示低濃度SAHA 選擇性誘導(dǎo)Teff細(xì)胞凋亡，從而間接增加了Treg 比例。盡管熒光定量PCR 檢測顯示SAHA在體外不能促進(jìn)Treg 擴(kuò)增或Teff 向Treg 轉(zhuǎn)化，但SAHA 可通過上調(diào)CTLA-4 增強(qiáng)Treg的抑制功能。（3）SAHA對Th17分化的影響:流式檢測顯示SAHA(0.1-1μM)顯著抑制IL-17A表達(dá)，低濃度SAHA 顯著抑制IL-

9、17A、IL-17F和STAT3表達(dá)，而不影響ROR γ t，提示SAHA 可能通過抑制STAT3通路抑制Th17分化。有趣的是，與對照組相比，SAHA 處理后的Th17中FOXP3表達(dá)顯著上調(diào)，顯示SAHA 可能參與調(diào)控Treg和Th17平衡。（4）在小鼠頸部異位心臟移植模型中，載體對照組移植物在7天內(nèi)即發(fā)生排斥反應(yīng)而停跳，而50mg/kg SAHA 顯著延長移植物中期存活時間（MST）至16天，而低于治療劑量的RPM （0.1mg/

10、kg）延長移植物MST 至10天，當(dāng)50mg/kg SAHA與低劑量RPM 聯(lián)合應(yīng)用時，顯著延長移植物MST 至26天；組織病理檢測顯示對照組伴隨著心肌結(jié)構(gòu)破壞和間質(zhì)細(xì)胞浸潤，SAHA 處理組移植物心肌結(jié)構(gòu)仍完整，但間質(zhì)細(xì)胞浸潤部分得到改善，而聯(lián)合用藥組既保持了心肌結(jié)構(gòu)完整又阻止了間質(zhì)細(xì)胞浸潤。移植物檢測發(fā)現(xiàn)SAHA 處理組Foxp3、CTLA-4、IL-10基因表達(dá)顯著上調(diào)，CD11b、IL-17、INF-γ表達(dá)下調(diào)，提示SAHA在體

11、內(nèi)促進(jìn)Treg分化而抑制Th1和Th17分化。（5）SAHA 處理組受者體內(nèi)胸腺、淋巴結(jié)和脾臟中Foxp3+T細(xì)胞比例顯著升高，其抑制功能與對照相比顯著增強(qiáng)；過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SAHA在體內(nèi)不能促進(jìn)外周CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+Foxp3+Treg，這些結(jié)果表明SAHA在體內(nèi)增加胸腺來源的天然Treg 數(shù)量，而非外周轉(zhuǎn)化；在IL-2-/-小鼠受者移植模型中，50mg/kg SAHA 無法延長移植物存活時間，由于IL-2對Tre

12、g 發(fā)育必不可少，這些結(jié)果提示Treg在SAHA 介導(dǎo)的抗移植排斥作用中至關(guān)重要。（5）熒光定量PCR 檢測顯示，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC7在Treg 活化后顯著升高，但SAHA 處理組與DMSO 處理組之間無顯著性差異，而HDAC9在活化后顯著降低，SAHA 處理組進(jìn)一步下調(diào)HDAC9表達(dá)，二者之間具有顯著性差異，體外通過小siRNA 干擾HDAC9 可顯著上調(diào)Foxp3和CTLA4基因表達(dá)，提示HDAC9在Tre

13、g 發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。
　　 結(jié)論：本文探討了SAHA對T淋巴細(xì)胞功能和移植排斥反應(yīng)的調(diào)控作用及分子機(jī)制。SAHA 被證實(shí)發(fā)揮多種T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)功能。高濃度SAHA在體外顯著促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，抑制T淋巴細(xì)胞增殖、活化和眾多促炎基因表達(dá)。而低濃度SAHA 顯著增強(qiáng)Treg的抑制功能并可能參與調(diào)控Treg和Th17平衡；體內(nèi)研究顯示SAHA通過增加胸腺來源Treg的數(shù)量和增強(qiáng)Treg的抑制功能而抑制急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。而HDAC