血管內(nèi)皮細(xì)胞微粒對(duì)T淋巴細(xì)胞功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落的內(nèi)皮微粒對(duì)體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞活化增殖、產(chǎn)生細(xì)胞因子及膜蛋白表達(dá)的影響,探討內(nèi)皮微粒對(duì)在急性排斥反應(yīng)中的作用及部分機(jī)制。
　　 方法:1.內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng):①人內(nèi)皮細(xì)胞株(Eahy926),用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng),至Eahy926細(xì)胞生長(zhǎng)成單層后備用;②大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVEC)的培養(yǎng)及鑒定:取健康Sprague Dawley(SD)大鼠的外周

2、肺組織,采用組織塊貼壁法建立大鼠PMVEC的原代培養(yǎng)技術(shù)。采用形態(tài)學(xué)觀察及第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)染色法對(duì)所培養(yǎng)的大鼠PMVEC進(jìn)行鑒定。2.誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化產(chǎn)生內(nèi)皮微粒:以TNF-α(100 ng/ml)刺激Eahy926細(xì)胞或第二代大鼠PMVEC,于48 h后收集培養(yǎng)液上清分離細(xì)胞微粒。3.內(nèi)皮微粒的分離及定量測(cè)定:采用高速離心法分離所收集培養(yǎng)液上清中的細(xì)胞微粒。Annexin V-FITC熒光染色,激光共聚焦顯微鏡下觀察所分離

3、微粒形態(tài),并采用Bradford法進(jìn)行定量測(cè)定。4.大鼠脾臟淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng):分離健康成年Brown-Norway(BN)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞并隨機(jī)分為正常對(duì)照組、不同濃度(10、20、40μg/ml)Eahy926細(xì)胞來源EMP干預(yù)組、ConA刺激組及PMYEC來源EMP(40μg/ml)干預(yù)組。5.檢測(cè)評(píng)價(jià)EMPs對(duì)T淋巴細(xì)胞的影響:①采用噻唑蘭比色法(MTT法)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增值程度;②采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞(CD3+淋巴細(xì)胞)早期

4、活化分子CD69的表達(dá);③采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-γ,IL-2)水平的表達(dá)。④采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞FasL mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.成功培養(yǎng)出狀態(tài)良好的PMVEC。細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的上皮樣細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞聚集成一片,外觀呈鵝卵石樣或鋪路石樣鑲嵌狀排列生長(zhǎng)。經(jīng)免疫組織化學(xué)對(duì)其內(nèi)皮特異性第Ⅷ因子相關(guān)抗原呈陽性表達(dá),證明成功培養(yǎng)出了高純度的PMVEC。2.EMP的誘生

5、及其分離鑒定結(jié)果:經(jīng)TNF-α刺激,內(nèi)皮細(xì)胞因活化而產(chǎn)生大量?jī)?nèi)皮微粒。激光共聚焦顯微鏡觀察,微粒因與Annexin V-FITC結(jié)合而呈綠色囊泡狀外觀。我們采用Bradford法定量所分離EMP,以蛋白量計(jì),EMP濃度在0.5～1μg/μl之間。3.淋巴細(xì)胞活化增殖測(cè)定:倒置顯微鏡直接觀察,各EMP干預(yù)組及ConA組細(xì)胞都有較高程度的聚集生長(zhǎng),較對(duì)照組增殖旺盛;MTT結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比較,各Eahy926細(xì)胞來源EMP干預(yù)組、Con

6、A組、PMVEC來源EMP干預(yù)組細(xì)胞代謝活力均顯著提高(P＜0.05);且與ConA組比較,EMP高濃度組、PMVEC來源EMP干預(yù)組細(xì)胞代謝活力的增高無顯著差異(P＞0.05)。4.T細(xì)胞早期活化標(biāo)志分子CD69的表達(dá):流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示,EMP各濃度組、ConA組、PMVEC來源EMP干預(yù)組CD3+細(xì)胞CD69分子的表達(dá)較對(duì)照組均明顯增高(P＜0.01);ConA組CD3+細(xì)胞CD69分子表達(dá)顯著高于其他各組(P＜0.01)。

7、5.ELISA結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比較,EMP各濃度組、ConA組、PMVEC來源EMP干預(yù)組培養(yǎng)液上清IFN-γ水平較對(duì)照組有顯著增高(P＜0.05),且EMP各濃度組間具有明顯的效量關(guān)系;而與對(duì)照組相比較,EMP中濃度組、EMP高濃度組、CortA組及PMVEC來源EMP干預(yù)組培養(yǎng)液上清IL-2水平顯著增高(P＜0.05),EMP低濃度組較空白對(duì)照組IL-2增高則無顯著性差異(P＞0.05)。6.FasL,mRNA水平的表達(dá):與對(duì)照

8、組相比,EMP中濃度組、EMP高濃度組、ConA組及PMVEC來源EMP干預(yù)組FasL mRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01);ConA組FasL mRNA的表達(dá)增高較各EMP干預(yù)組具有顯著差異(P＜0.05);且EMP高濃度組與PMVEC來源EMP干預(yù)組細(xì)胞FasL mRNA表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:研究發(fā)現(xiàn)Eahy926細(xì)胞來源EMP及原代PMVEC來源EMP均可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞活化增殖,誘導(dǎo)T