腫瘤淋巴管內(nèi)皮細胞靶向成像的實驗研究.pdf

1、腫瘤內(nèi)的淋巴管生成也是影響腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后的一個重要因素，可作為腫瘤診斷、預(yù)后及療效評價的重要指標(biāo)。目前淋巴管的相關(guān)研究主要是通過淋巴管內(nèi)皮細胞(lymphatic endothelial cell，LEC)表達的相關(guān)標(biāo)記物對腫瘤內(nèi)淋巴管進行識別檢測，評價活體腫瘤內(nèi)淋巴管發(fā)生、發(fā)展以及與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)系一直是淋巴管研究領(lǐng)域的熱點與難點。雖然從理論上講，經(jīng)靜脈注入的CT(computedtomography)、磁共振(magnetic r

2、esonance，MR)造影劑可以進入腫瘤細胞間質(zhì)內(nèi)，經(jīng)過腫瘤新生淋巴管回流入靜脈系統(tǒng)，但因為腫瘤內(nèi)血管同時成像，無法區(qū)分腫瘤內(nèi)淋巴管及微小血管。隨著分子影像學(xué)的出現(xiàn)與迅速發(fā)展，為活體評價腫瘤內(nèi)淋巴管生成提供了可能性。分子影像學(xué)是建立在傳統(tǒng)的成像技術(shù)基礎(chǔ)之上，以特殊的分子作為成像對象，其根本宗旨是將非特異性物理成像轉(zhuǎn)為特異性分子成像。如果能通過此成像技術(shù)對腫瘤內(nèi)的淋巴管進行靶向成像，相信將對淋巴管與腫瘤關(guān)系的評估提供更豐富的依據(jù)。因此，

3、本研究的主要目的為構(gòu)建一種能夠靶向淋巴管內(nèi)皮細胞的磁共振分子影像探針，研究此探針應(yīng)用于淋巴管內(nèi)皮細胞磁共振靶向成像的可行性。
　　 材料與方法：
　　 腫瘤動物模型的確定及抗體的篩選:分別建立Lewis小鼠皮下移植瘤模型及colon26小鼠皮下移植瘤模型，通過免疫組化檢測方法對Lewis、colon26小鼠腫瘤模型及抗淋巴管透明質(zhì)酸受體-1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan

4、receptor-1，LYVE-1)單克隆抗體、抗podoplanin單克隆抗體進行雙向選擇，篩選出一種淋巴管豐富的腫瘤模型及針對腫瘤內(nèi)淋巴管相對較為特異的抗體。
　　 分子探針的制備、表征分析及細胞體外實驗:采用納米鐵高溫?zé)岱纸庵苽浞椒?，利用“一鍋”反?yīng)制備出表面修飾有聚乙二醇(polyehtylene glycol，PEG)的超微型超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagenetic iron oxid

5、e，USPIO)磁性納米鐵顆粒PEG-USPIO，并將PEG-USPIO與抗LYVE-1單克隆抗體共價耦聯(lián)，制備本研究所設(shè)計的磁共振分子影像探針LYVE-1-PEG-USPIO。通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察PEG-USPIO及LYVE-1-PEG-USPIO兩種納米顆粒的形態(tài);激光粒度儀測定兩種納米顆粒的z平均水合粒徑及zeta電位;通過磁共振成像（magnetic

6、 resonance imaging，MRI）測定兩種納米顆粒的弛豫率。小鼠淋巴管內(nèi)皮細胞（mouse lymphatic endothelial cell，MLEC）及colon26細胞的培養(yǎng)與傳代;以25及100μg Fe/mL濃度的LYVE-1-PEG-USPIO及PEG-USPIO體外標(biāo)記MLEC及colon26細胞后經(jīng)普魯士藍染色，分別收集每組染色后的標(biāo)記細胞通過原子吸收光譜法（atomic absorption spectr

7、oscopy, AAS）測定細胞結(jié)合鐵量;TEM觀察LYVE-1-PEG-USPIO及PEG-USPIO納米顆粒在MLEC及colon26細胞內(nèi)的結(jié)合情況;對系列濃度的LYVE-1-PEG-USPIO及PEG-USPIO孵育的MLEC及colon26細胞懸液進行MRI T2加權(quán)成像(T2 weighted imaging，T2WI)成像，研究MR信號改變與孵育探針濃度的關(guān)系，并利用AAS測定各組標(biāo)記細胞的結(jié)合鐵量，研究細胞結(jié)合鐵量與孵育

8、探針濃度的關(guān)系。
　　 分子探針MR體內(nèi)實驗:建立Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型，待腫瘤直徑約1.5-2.0cm時進行MR掃描;10只小鼠注射LYVE-1-PEG-USPIO溶液，10只小鼠注射PEG-USPIO溶液，給藥前先進行腫瘤軸位層面MR T2WI、SWAN、T2*WI序列掃描，給藥后于不同時間段進行掃描;掃描完成后，留取腫瘤及肝、脾、肺、骨骼肌、舌、腎、胃及心肌組織標(biāo)本，行普魯士藍染色及免疫組化染色。
　　

9、統(tǒng)計學(xué)分析采用spssl6.0軟件。數(shù)據(jù)中計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間計量資料差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。鐵含量與R2之間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 腫瘤動物模型的確定及抗體的篩選結(jié)果:Lewis小鼠腫瘤模型內(nèi)抗LYVE-1單克隆抗體及抗podoplanin單克隆抗體陽性淋巴管豐富，但此腫瘤內(nèi)利用抗podoplanin單克隆抗

10、體染色除可見陽性淋巴管外，還可見大量抗podoplanin單克隆抗體陽性的細胞，而抗LYVE-1單克隆抗體染色結(jié)果中未見非淋巴管結(jié)構(gòu)的陽性細胞著色。另外，colon26小鼠腫瘤模型內(nèi)未見兩種抗體陽性染色的淋巴管結(jié)構(gòu)。
　　 分子探針的制備、表征分析及細胞體外實驗結(jié)果:成功制備出LYVE-1-PEG-USPIO分子探針;通過TEM觀察PEG-USPIO及LYVE-1-PEG-USPIO兩種納米顆粒呈類圓形，顆粒大小較為一致;動態(tài)光

11、散射法(dynamic light scattering，DLS)測定PEG-USPIO及LYVE-1-PEG-USPIO兩種納米顆粒的粒徑分別為47.91±0.73nm和57.42±0.31nm，zeta電位分別為2.57±0.83mV和12.38±4.87mV;經(jīng)MRI測定PEG-USPIO和LYVE-1-PEG-USPIO兩種納米顆粒的弛豫率分別為608.32 mM-1s-1和185.48 mM-1s-1。普魯士藍染色結(jié)果提示兩種

12、細胞對兩種納米顆粒的結(jié)合能力不同，AAS測定結(jié)果進一步表明在給予兩種對比劑含鐵濃度相同條件下，MLEC對LYVE-1-PEG-USPIO的結(jié)合量最高;標(biāo)記細胞的TEM結(jié)果顯示LYVE-1-PEG-USPIO納米顆粒主要存在于MLEC細胞質(zhì)中的核內(nèi)體中，細胞膜外表面亦可見納米顆粒的結(jié)合，LYVE-1-PEG-USPIO納米顆粒主要結(jié)合于colon26細胞膜外表面，偶可見于細胞質(zhì)內(nèi)核內(nèi)體中，而PEG-USPIO主要結(jié)合于MLEC及colon

13、26細胞膜外表面;MRI T2WI結(jié)果表明，隨著給予LYVE-1-PEG-USPIO或PEG-USPIO濃度的增加，MR T2信號減低，當(dāng)給予納米顆粒濃度等于或高于25μtg Fe/mL時，在同一濃度條件下以LYVE-1-PEG-USPIO標(biāo)記的MLEC信號減低較為明顯，AAS測定結(jié)果進一步表明細胞結(jié)合鐵量隨給予納米顆粒濃度的增加而呈逐漸增高趨勢，當(dāng)給予納米顆粒濃度等于或高于25μg Fe/mL時，同一濃度條件下，MLEC對LYVE-1

14、-PEG-USPIO的結(jié)合量最為顯著(P＜0.05)，且MRI R2值與AAS測定細胞結(jié)合鐵量具有較好的相關(guān)性。
　　 分子探針MR體內(nèi)實驗結(jié)果:從注射LYVE-1-PEG-USPIO組及PEG-USPIO組的T2WI、SWAN、T2*WI掃描圖像可見腫瘤區(qū)信號強度從給藥10min后至12h期間逐漸減低，到24h時腫瘤區(qū)信號強度有所增加，但仍低于平掃時信號，SWAN序列掃描圖像中測得24h時兩組腫瘤的信號噪聲比值（Signal

15、to Noise Ratio，SNR）有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，而T2WI及T2*WI序列掃描圖像中測得24h時兩組腫瘤的SNR無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);腫瘤組織免疫組化及普魯士藍染色對比分析結(jié)果顯示，注射LYVE-1-PEG-USPIO組腫瘤組織邊緣部可見普魯士藍陽性染色的淋巴管并可與免疫組化染色的淋巴管結(jié)構(gòu)相對應(yīng)，而注射PEG-USPIO組腫瘤組織內(nèi)未見普魯士藍陽性染色的淋巴管。其他組織的普魯士藍染色結(jié)果顯示，除肝臟、脾臟及