淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞體外對(duì)食管癌細(xì)胞增殖侵襲及體內(nèi)對(duì)淋巴管生成的影響.pdf

1、食管癌是一種由食管黏膜上皮或腺體發(fā)生的惡性腫瘤，是常見的消化道惡性腫瘤之一。食管癌有明顯的地域差異性，在我國(guó)西北及華北地區(qū)多見，尤其是河南省林州市食管癌的發(fā)病率和死亡率居全國(guó)首位，我國(guó)食管癌發(fā)病率和死亡率也是世界最高。食管鱗狀細(xì)胞癌是食管癌最多見的組織學(xué)類型，其淋巴道轉(zhuǎn)移是食管癌患者病情發(fā)展或死亡的重要原因之一。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)屬于MMPs家族，可以降解基

2、底膜成分和細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。金屬蛋白酶組織抑制劑-2(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-2，TIMP-2)是TIMPs家族成員之一，能夠特異性抑制MMP活性和細(xì)胞基底膜的降解，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPs和TIMPs之間的平衡對(duì)于維持細(xì)胞外基質(zhì)的完整狀態(tài)起重要作用。MMPs與TIMPs之間失衡是造成腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素之一。研究表明，MMP-9在多種惡性

3、腫瘤中表達(dá)增高，MMP-9在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于正常組織。TIMP-2可以抑制所有MMPs，TIMP-2的表達(dá)與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TIMP-2低表達(dá)或呈陰性。
　　腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移是腫瘤擴(kuò)散及發(fā)展的重要途徑，腫瘤相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞是腫瘤發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的重要界面，腫瘤細(xì)胞與其微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用是腫瘤細(xì)胞淋巴道播散的關(guān)鍵步驟。目前對(duì)食管癌細(xì)胞與食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞之間相互關(guān)系的研究尚未見報(bào)道，本實(shí)

4、驗(yàn)使用不同淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)高分化食管癌EC9706細(xì)胞和低分化食管癌KYSE150細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中MMP-9、TIMP-2蛋白表達(dá)水平;采用原位雜交、RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中MMP-9、TIMP-2 mRNA表達(dá)水平;采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況;采用Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力。通過(guò)構(gòu)建裸鼠食管癌移植瘤模型，對(duì)各組移植瘤及周圍組織進(jìn)行D2-40、L

5、YVE-1免疫組化染色，標(biāo)記微淋巴管并測(cè)定微淋巴管密度(LMVD)，探討不同分化程度的食管癌細(xì)胞與食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互影響，為臨床阻斷食管癌等惡性腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移奠定重要的理論基礎(chǔ)。
　　材料和方法：
　　1.人食管鱗癌EC9706細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);人食管鱗癌KYSE150細(xì)胞和人食管癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)買于上海拜力生物科技有限公司;幼兒真皮來(lái)源的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)買

6、于美國(guó)Sciencell公司;Balb/c裸鼠購(gòu)買于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。
　　2.將食管癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和正常人幼兒真皮來(lái)源的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞在同等條件下培養(yǎng)，待第二代細(xì)胞融合后，采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，收集兩組相應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
　　3.采用兩組內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基分組培養(yǎng)EC9706細(xì)胞和KYSE150細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)24h后收集各組細(xì)胞。
　　4.細(xì)胞培養(yǎng)分組:共分成3大組培

7、養(yǎng)，即實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組（即E組）分為E1組和E2組。E1組:EC9706細(xì)胞換用食管癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng);E2組:KYSE150細(xì)胞換用食管癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（即C組）分為C1組和C2組。C1組:EC9706細(xì)胞換用正常人幼兒真皮來(lái)源的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng);C2組:KYSE150細(xì)胞換用正常人幼兒真皮來(lái)源的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)?？瞻讓?duì)照組（即K組）分

8、為K1組和K2組。K1組:EC9706細(xì)胞繼續(xù)使用原培養(yǎng)基培養(yǎng);K2組:KYSE150細(xì)胞繼續(xù)使用原培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　5.采用免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中MMP-9、TIMP-2蛋白表達(dá);采用原位雜交、RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中MMP-9、TIMP-2 mRNA表達(dá)。
　　6.CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。
　　7.Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲力。
　　8.構(gòu)建裸鼠食管

9、癌移植瘤模型，裸鼠分組按照上述培養(yǎng)食管癌細(xì)胞的分組。裸鼠接種腫瘤細(xì)胞5周后處死并取瘤，計(jì)算各組瘤體體積。
　　9.對(duì)各組移植瘤及周圍組織進(jìn)行D2-40、LYVE-1免疫組化染色，標(biāo)記微淋巴管并測(cè)定LMVD。
　　10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MMP-9、TIMP-2蛋白表達(dá):MMP-9蛋白在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且

10、顯著高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);MMP-9蛋白在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的表達(dá)量高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);MMP-9蛋白在實(shí)驗(yàn)組中E2組的表達(dá)量高于E1組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TIMP-2蛋白在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且顯著低于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);TIMP-2蛋白在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的表達(dá)量低于空白對(duì)照組，

11、兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); TIMP-2蛋白在實(shí)驗(yàn)組中E2組的表達(dá)量低于E1組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.原位雜交法檢測(cè)MMP-9、TIMP-2 mRNA表達(dá):MMP-9 mRNA在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，并顯著高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);MMP-9 mRNA在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的表達(dá)量高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

12、5); MMP-9 mRNA在實(shí)驗(yàn)組中E2組的表達(dá)量高于E1組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TIMP-2mRNA在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且顯著低于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);TIMP-2 mRNA在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的表達(dá)量低于空白對(duì)照組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); TIMP-2 mRNA在實(shí)驗(yàn)組中E2組的表達(dá)量低于E1組，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0

13、5）。
　　3.RT-PCR法檢測(cè)MMP-9、TIMP-2 mRNA表達(dá):MMP-9 mRNA在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，并顯著高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);MMP-9 mRNA在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的表達(dá)量高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); MMP-9 mRNA在實(shí)驗(yàn)組中E2組的表達(dá)量高于E1組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TIMP-2mRNA在實(shí)驗(yàn)

14、組中的表達(dá)量低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且顯著低于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);TIMP-2 mRNA在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的表達(dá)量低于空白對(duì)照組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);TIMP-2 mRNA在實(shí)驗(yàn)組中E2組的表達(dá)量低于E1組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.Western blot法檢測(cè)MMP-9、TIMP-2蛋白表達(dá):MMP-9蛋白在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且

15、顯著高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);MMP-9蛋白在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的表達(dá)量高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); MMP-9蛋白在實(shí)驗(yàn)組中E2組的表達(dá)量高于E1組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TIMP-2蛋白在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且顯著低于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）;TIMP-2蛋白在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的表達(dá)量低于空白對(duì)照組

16、，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); TIMP-2蛋白在實(shí)驗(yàn)組中E2組的表達(dá)量低于E1組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)，其中E2組細(xì)胞的增殖能力高于E1組，且E2組細(xì)胞在所有分組的細(xì)胞中增殖能力最強(qiáng);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且顯著高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力高

17、于空白對(duì)照組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲力:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)最多，其中E2組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)多于E1組，且E2組細(xì)胞在所有分組的細(xì)胞中穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)最多，細(xì)胞侵襲能力最強(qiáng);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且顯著高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

18、義(P＜0.05)。
　　7.裸鼠接種食管癌細(xì)胞后皮下移植瘤明顯，成瘤后每2-3天測(cè)量各組裸鼠成瘤體積，成瘤5周后處死裸鼠，測(cè)量各組瘤體體積分別為:2542.21±12.65、2872.42±13.12、2264.51±13.95、2334.27±14.03、1437.56±17.37和1643.31±14.09，實(shí)驗(yàn)組裸鼠成瘤體積最大，其中E2組裸鼠移植瘤體積大于E1組，且E2組移植瘤體積在所有分組的移植瘤中體積最大，兩者比較，

19、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組（E組）裸鼠移植瘤體積大于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（C組），且顯著大于空白對(duì)照組（K組），兩者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與空白對(duì)照組兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　8.D2-40、LYVE-1標(biāo)記微淋巴管并測(cè)定LMVD:實(shí)驗(yàn)組的兩組食管癌移植瘤體及周圍組織中D2-40、LYVE-1標(biāo)記的LMVD高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且顯著高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異均具有統(tǒng)

20、計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);其中E2組D2-40、LYVE-1標(biāo)記的LMVD最高，且E2組高于E1組，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中D2-40、LYVE-1標(biāo)記的LMVD高于空白對(duì)照組，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.食管鱗癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞可體外促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。
　　2.食管鱗癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)不同分化程度的食管鱗癌細(xì)胞影響不同