VEGF-C和-D在鼻咽癌中的表達及阻斷VEGF-C作用對淋巴管內皮細胞和鼻咽癌細胞增殖的影響.pdf

1、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種惡性程度較高的頭頸部惡性腫瘤，在歐洲、北美洲、大洋洲和拉丁美洲等西方國家較少見，在我國則是最常見的惡性腫瘤之一。全世界約80％鼻咽癌發(fā)生在我國，尤以廣東省珠江三角洲流域最常見，所以鼻咽癌也被稱為“廣東瘤”(Canton Tumor)。鼻咽癌對放療很敏感，放射治療是鼻咽癌的主要治療手段。鼻咽癌對化療也較敏感，目前鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期經(jīng)過綜合治療的五年生存率分別是95

2、％、80％、62％、40％。但鼻咽癌病人就診時大部分(約70％)為中晚期，中晚期鼻咽癌有較高的局部復發(fā)率及遠處轉移率，嚴重影響了鼻咽癌生存率的提高。鼻咽癌的轉移途徑包括局部浸潤、淋巴轉移和血行轉移。其中頸淋巴結轉移是鼻咽癌最主要的轉移途徑和部位，發(fā)生率可高達78.9％，而且轉移出現(xiàn)早，與預后密切相關。如何提高鼻咽癌的局控率、減少轉移，是目前鼻咽癌研究的主要任務之一。 轉移是所有惡性腫瘤最主要的行為特征，也是導致腫瘤治療失敗、患者

3、死亡的主要原因之一。如何控制腫瘤轉移是目前腫瘤治療中的難題之一。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移的主要途徑是淋巴轉移和血行轉移，腫瘤誘導淋巴管和血管形成、增生是腫瘤生長、轉移的先決條件。自上世紀70年代開始，腫瘤誘導血管生成對腫瘤轉移的影響已為越來越多的腫瘤研究者所重視，目前抗腫瘤血管生成治療已成為抗腫瘤研究熱點之一，抗腫瘤血管生成治療(如貝伐單抗Bevacizumab，商品名Avastin，一種重組的人源化單克隆IgG1抗體，是血管內皮生長因子抑制劑

4、)已進入臨床并取得了良好的治療效果。而腫瘤轉移的另一重要方式——淋巴轉移，研究相對落后。而臨床病理學研究證實：大多數(shù)上皮起源的實體瘤以淋巴道轉移為主，最早發(fā)生的是區(qū)域淋巴結播散，而播散的最早途徑是淋巴管通道。因此目前對腫瘤淋巴道擴散與轉移機制的基礎和臨床研究對于攻克惡性腫瘤更具重要性和迫切性。近幾年國外研究表明：淋巴管生成是受血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族的成員血管

5、內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF—C)和血管內皮生長因子D(vascular endothelial growth factor D，VEGF—D)控制，這些生長因子分泌激活后主要與血管內皮生長因子受體3(vascular endothelial growth factot receptor 3，VEGFR-3，即Flt-4)結合，可促進淋巴管內皮細胞增殖和淋巴管增生，促

6、進腫瘤淋巴道轉移，而直接針對VEGF-C/VEGF—D或其受體VEGFR-3的腫瘤淋巴管生成抑制劑，可能對人類腫瘤的抗淋巴道轉移治療有益。但目前此領域的研究相對較少。 基于以上研究現(xiàn)狀，本課題擬從臨床病理標本和細胞分子生物學水平兩個部分，研究鼻咽癌中VEGF-C和-D的表達情況及其與區(qū)域淋巴結轉移、遠期生存等腫瘤生物學特征的關系，并初步探討VEGF-C在鼻咽癌淋巴管生成中的調控機制，試圖為探尋新的抗鼻咽癌淋巴轉移的治療手段提供思

7、路。 1.背景及目的VEGF—C和VEGF—D是目前已鑒定出的淋巴管內皮生長因子，一些研究表明腫瘤組織中VEGF—C或VEGF-D過表達和淋巴轉移有關。本研究旨在探討鼻咽癌中VEGF-C和VEGF-D的表達情況及其臨床意義。 2.方法 采用SP法免疫組化染色技術檢測66例鼻咽癌組織中VEGF-C和VEGF-D的表達情況，同時檢測VEGFR-3和CD34染色情況并計數(shù)微淋巴管密度(lymphatic microve

8、ssel density ，MVD)和微血管密度(microvessel density，MVD)。 3.結果 VEGF—C陽性高表達率在鼻咽癌組織中(54.5％)較鼻咽非腫瘤組織中(26.3％)高(P<0.05)；鼻咽癌中VEGF-C高表達者較低表達者區(qū)域淋巴結轉移率增高(62.0％：38.096)、T分期也相對增高，單因素及多因素Logistic回歸分析均表明區(qū)域淋巴結轉移與VEGF-C高表達相關(P<0.05)，但

9、VEGF-C高表達與性別、年齡、5年生存、LMVD、MVD等因素無關(P>0.05)。VEGF-D陽性表達率在鼻咽癌組織中(69.7％)較鼻咽非腫瘤組織中(42.1％)高(P<0.05)；鼻咽癌中VEGF-D陽性表達與性別、年齡、T分期、區(qū)域淋巴結轉移、LMVD、MVD等因素無關(P>0.05)，但與VEGF-C高表達呈顯著正相關(P<0.01)，VEGF-D陽性表達者5年生存率(50.0％)顯著低于VEGF—D不表達者(85.0％)(

10、P<0.01)。 4.結論 鼻咽癌中VEGF-C陽性高表達與區(qū)域淋巴結轉移密切相關；VEGF-D陽性表達與區(qū)域淋巴結轉移無關，但與VEGF-C陽性高表達呈正相關，且與5年生存率密切相關。 1.背景與目的VEGF—C通過與受體VEGFR-3結合，可促進淋巴管內皮細胞增殖和淋巴管增生，促進腫瘤淋巴道轉移。本研究旨在檢測人鼻咽癌細胞株中VEGF-C表達情況，并探討體外阻斷VEGF-C作用對淋巴管內皮細胞和鼻咽癌細胞增殖

11、的影響。 2.方法 2.1.采用定性RT—PCR和實時熒光定量RT—PCR檢測三株常見人鼻咽癌細胞株中VEGF-C的表達情況。 2.2.取人淋巴管內皮細胞(human lymphatic endothelial cell，HLEC)，調整細胞數(shù)為5×103/ml，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100ul。實驗分為5組，細胞生長24小時后，每孔加入各種試劑100u1。第①組：HLEC．VS．HLEC+抗VEGFR-3抗體；

12、第②組：HLEC．VS．HLEC+高表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清；第⑨組：HLEC+高表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清．VS．HLEC+高表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清+抗VEGFR-3抗體；第④組：HLEC．VS．HLEC+低表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清；第⑤組：HLEC+低表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清．VS．HLEC+低表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清+抗VEGFR-3抗體。加試劑后24h、48h、72h、96h、12

13、0h觀察各組淋巴管內皮細胞生長情況并計算細胞數(shù)，比較各組細胞增殖情況。 2.3.分別收集高表達VEGF-C的人鼻咽癌細胞和低表達VEGF-C的人鼻咽癌細胞，調整細胞計數(shù)為5X104/ml，將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種量為1X104個細胞，體積為200ul。實驗分為兩組，第①組：高表達VEGF-C的鼻咽癌細胞．VS．高表達VEGF—C的鼻咽癌細胞+抗VEGFR-3抗體；第②組：低表達VEGF-C的鼻咽癌細胞．VS．低表達VEGF

14、-C的鼻咽癌細胞+抗VEGFR-3抗體。加試劑后24h、48h、72h、96h、120h用MTT法檢測各組細胞增殖情況。 3.結果 3.1.定性RT—PCR發(fā)現(xiàn)三株常見人鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2和HNE2均表達VEGF-C，實時熒光定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，這三株人鼻咽癌細胞VEGF-C mRNA差異較大，分別是1.02×106 copy/μg、3.11×104 copy/μg和8.31×104 copy/μg。

15、 3.2.加入抗VEGFR-3抗體的HLEC和未用抗VEGFR-3抗體處理的HLEC增殖速度無明顯差異(P=0.625)；加入高表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清后，HLEC增殖速度明顯加快(P=0.031)；加入高表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清的同時加入抗VEGFR-3抗體，HLEC的增殖速度較僅加入高表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清的HLEC的明顯減慢(P=0.038)；加入低表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清后，HLEC的增殖速度

16、也加快，但沒有統(tǒng)計學意義(P=0.054)；加入低表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清的同時加入抗VEGFR-3抗體，HLEC的增殖速度較僅加入低表達VEGF-C的鼻咽癌細胞上清的HLEC的也有所減慢，但也沒有統(tǒng)計學意義(P=0.062)。 3.3.向高表達VEGF-C的鼻咽癌細胞培養(yǎng)液中加入抗VEGFR-3抗體，鼻咽癌細胞增殖速度明顯減慢(P=0.019)；向低表達VEGF-C的鼻咽癌細胞培養(yǎng)液中加入抗VEGFR-3抗體，鼻咽癌細

17、胞的增殖速度稍減慢，但沒有統(tǒng)計學意義(P=0.080)。 4.結論 4.1.三株常見的人鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2和HNE2均表達VEGF-C，但差異較大。 4.2.鼻咽癌細胞分泌VEGF-C對HLEC有促增殖作用，阻斷VEGF-C作用可以阻斷其對HLEC的促增殖作用。但低于一定濃度閾值的VEGF-C對HLEC促增殖作用不明顯，這種情況下阻斷VEGF-C作用對HLEC增殖影響不大。 4.3.阻斷鼻咽癌