食管鱗癌細胞及VEGF-C siRNA對淋巴管內(nèi)皮細胞增殖及成環(huán)能力的影響.pdf

1、研究背景：
　　食管癌是當(dāng)今世界上嚴重危害人類生命與健康的惡性腫瘤之一，我國的食管癌的發(fā)病率高居世界首位，尤其是在太行山脈附近的省份明顯高發(fā)。淋巴道轉(zhuǎn)移是食管癌早期轉(zhuǎn)移的重要途徑，同時也是惡性腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的主要原因。淋巴管內(nèi)皮細胞作為淋巴管最基本的單元，是食管癌淋巴道轉(zhuǎn)移的重要界面。
　　不同分化程度的食管癌的轉(zhuǎn)移力和侵襲力是不同的，促進其相關(guān)淋巴管的生成能力也是不同的。淋巴管內(nèi)皮細胞的調(diào)控因子有多種，其中血管內(nèi)皮生長因

2、子VEGF-C是目前公認的淋巴管生成的主要調(diào)控因子，可以與淋巴管內(nèi)皮細胞表面的VEGFR-3結(jié)合，誘導(dǎo)VEGFR-3發(fā)生酪氨酸激酶磷酸化，促進惡性腫瘤內(nèi)淋巴管生成，從而導(dǎo)致腫瘤細胞侵入周圍淋巴結(jié)及遠處擴散。而Endostatin是一種很強的血管生成抑制因子，能夠抑制淋巴管生長因子VEGF-C的作用，在體外強烈的抑制淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖和游走，并明顯地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，還可以誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞的凋亡，從而抑制了腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移。

3、>　　本課題采用不同分化程度的食管鱗癌細胞的培養(yǎng)上清液三維培養(yǎng)食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞，觀察其對食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞增殖及成環(huán)能力韻影響;構(gòu)建針對VEGF-C的慢病毒載體或pSINsi-U6-siRNA真核表達載體及應(yīng)用endostatin分別處理不同分化程度的食管鱗癌細胞后，取其培養(yǎng)上清液再處理食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞，觀察對食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞體外成環(huán)能力及增殖的影響，探討腫瘤源性微淋巴管內(nèi)皮細胞與食管鱗癌細胞間的相

4、互作用及其可能機制，為進一步探討食管癌淋巴道轉(zhuǎn)移機制及其阻斷研究提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　研究不同分化程度的食管鱗癌細胞系細胞對腫瘤微淋巴管內(nèi)皮細胞體外成環(huán)及增殖的影響;研究VEGF-CsiRNA真核表達載體及endostatin對食管鱗癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞體外成管能力及增殖的影響。
　　方法：
　　1.采用免疫細胞化學(xué)及Western Blot方法檢測食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞中VEGFR-3、LYVE-1

5、、Podoplanin、Prox-1蛋白的表達;采用原位雜交方法檢測食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin、 Prox-1mRNA的表達;
　　2.培養(yǎng)高分化食管鱗癌EC9706細胞及低分化食管鱗癌KYSE150細胞，收集其無血清培養(yǎng)基上清，作為食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞的條件培養(yǎng)基;分組三維培養(yǎng)食管癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細胞:E1組加入EC9706條件培養(yǎng)基，E2組加入KYSE150條件培養(yǎng)基，K組

6、不更換培養(yǎng)基。計數(shù)三組細胞形成的管樣結(jié)構(gòu)。消化各組細胞，采用CCK-8方法檢測細胞增殖情況。
　　3.構(gòu)建慢病毒載體和真核表達載體，進行侵/轉(zhuǎn)染效率評價，選擇最優(yōu)方式。針對人源VEGF-C設(shè)計3條干擾序列SG0、SG1、SG2，并篩選出最佳干擾序列。
　　4.內(nèi)皮素抑制試驗:用不同濃度的endostatin處理EC9706細胞和KYSE150細胞，采用CCK-8方法選取最佳抑制濃度。
　　5.將EC9706細胞和KYS

7、E150細胞進行細胞轉(zhuǎn)染和endostatin處理，并制備條件培養(yǎng)基。分組如下:空白對照組:未轉(zhuǎn)染的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。陰性對照組:轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。SG1組:轉(zhuǎn)染SG1質(zhì)粒的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。SG2組:轉(zhuǎn)染SG2質(zhì)粒的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。內(nèi)皮抑素組:最佳濃度內(nèi)皮抑素處理的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。陰性+內(nèi)皮抑素組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒后又經(jīng)最佳濃度內(nèi)皮抑素處理的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。SG1+內(nèi)抑皮素組:轉(zhuǎn)染SG

8、1后又經(jīng)最佳濃度內(nèi)皮抑素處理的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。SG2+內(nèi)抑皮素組:轉(zhuǎn)染SG2后又經(jīng)最佳濃度內(nèi)皮抑素處理的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基
　　6.按照上述分組三維培養(yǎng)食管癌相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細胞并計數(shù)各組細胞形成的管樣結(jié)構(gòu)。消化各組細胞，運用CCK-8方法檢測細胞增殖情況。
　　7.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS17.0軟件處理，計量資料進行單因素方差分析，多組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t法，檢驗水準α=0.05。
　　結(jié)果：

9、
　　1.免疫細胞化學(xué)、Western Blot及原位雜交檢查結(jié)果顯示:VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin、Prox-1蛋白及mRNA在食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞中均有表達。
　　2.三維培養(yǎng)結(jié)果顯示:在每一個時間點上，食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞成環(huán)的數(shù)目E1組＞E2組＞K組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）;隨著時間的延長，E1組和E2組的成環(huán)數(shù)均有不同程度的減少。
　　3.CCK-8法檢測結(jié)果:三組細

10、胞的增值情況為E1組＞E2組＞K組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.侵/轉(zhuǎn)染效率評價結(jié)果:KYSE150細胞侵染效率為90％以上，轉(zhuǎn)染效率為70％左右，可以進行下游實驗;EC9706細胞侵染效率約為30％左右，轉(zhuǎn)染效率約為50％左右，達不到下游實驗要求。在此，選擇質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進行后續(xù)試驗。
　　5.質(zhì)粒篩選結(jié)果:轉(zhuǎn)染后，EC9706和KYSE150細胞中SG1和SG2中VEGF-C蛋白的表達量明顯低于其他各組，即SG

11、1和SG2的抑制效果均優(yōu)于其他組。
　　6.三維培養(yǎng)結(jié)果:
　　6.1 EC9706細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組細胞的成環(huán)結(jié)果中，空白對照組＞陰性對照組＞內(nèi)皮抑素組＞陰性+內(nèi)皮抑素組＞SG2組＞SG1組＞SG2+內(nèi)皮抑素組＞SG1+內(nèi)皮抑素組，其中兩對照組之間比較，SG1+內(nèi)皮抑素組和SG2+內(nèi)皮抑素組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，SG1組、SG2組、內(nèi)皮抑素組、陰性+內(nèi)皮抑素組分別兩兩比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意

12、義(P＞0.05)。余各組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.2 KYSE150細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組細胞的成環(huán)結(jié)果中，總體上比較，陰性對照組＞空白對照組＞NC+內(nèi)皮抑素組＞內(nèi)皮抑素組＞ SG2組＞SG1組＞SG1+內(nèi)皮抑素組＞SG2+內(nèi)皮抑素組，其中兩對照組之間比較，SG1+內(nèi)皮抑素組和SG2+內(nèi)皮抑素組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);SG1組、SG2組、內(nèi)皮抑素組、NC+內(nèi)皮抑素組分別

13、兩兩比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);余各組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.3將EC9706細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組和KYSE150細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組進行比較，經(jīng)過處理后的KYSE150細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞的成環(huán)數(shù)高于EC9706細胞的條件培養(yǎng)基。
　　7.CCK-8結(jié)果:
　　7.1在EC9706細胞收取的條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)后各

14、組細胞的增殖情況中，各組活細胞數(shù)空白對照組＞陰性對照組＞內(nèi)皮抑素組＞陰性+內(nèi)皮抑素組＞ SG2組＞ SG1組＞SG1+內(nèi)皮抑素組＞SG2+內(nèi)皮抑素組，SG2組和內(nèi)皮抑素組比較，SG2組和陰性+內(nèi)皮抑素組比較，內(nèi)皮抑素組和陰性+內(nèi)皮抑素組比較，SG1+內(nèi)皮抑素組和SG2+內(nèi)皮抑素組比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。余各組進行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　7.2在KYSE150細胞收取的條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)

15、后各組細胞的增殖情況中，各組活細胞數(shù)空白對照組＞陰性對照組＞內(nèi)皮抑素組＞ SG2組＞SG1組＞陰性+內(nèi)皮抑素組＞SG1+內(nèi)皮抑素組＞SG2+內(nèi)皮抑素組，兩對照組比較，SG1組和SG2組比較，SG1組和內(nèi)皮抑素組比較，SG1組和陰性+內(nèi)皮抑素組比較，SG2組和內(nèi)皮抑素組比較，SG2組和陰性+內(nèi)皮抑素組比較，SG1+內(nèi)皮抑素組和SG2+內(nèi)皮抑素組比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。余各組進行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。<

16、br>　　7.3將EC9706細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組和KYSE150細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組進行比較，經(jīng)過處理后的KYSE150細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖量高于EC9706細胞的條件培養(yǎng)基。
　　結(jié)論：
　　1、不同分化程度的食管癌細胞均可促進食管癌微淋巴管內(nèi)皮細胞的體外成環(huán)及增殖能力，低分化食管癌細胞效應(yīng)更為明顯。
　　2、VEGF-C siRNA及endostat