Smad7siRNA對食管鱗癌細(xì)胞株EC-1增殖及侵襲的影響.pdf

1、食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,它是一種高侵襲性的腫瘤。Smad7是TGF-β信號通路元件之一,對TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮負(fù)性調(diào)控,抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程如下:活化的TGF-β首先直接與Ⅱ型受體結(jié)合(TβRⅡ)形成復(fù)合物,TGF-β構(gòu)型發(fā)生變化,從而可被Ⅰ型受體(TβRⅠ)識別并結(jié)合,形成TβRⅡ-TGF-β-TβRⅠ三聚體復(fù)合物,復(fù)合物中的TβRⅠ被TβRⅡ磷酸化,磷酸化的TβRⅠ在胞漿內(nèi)與R-Smads(S

2、mad2,Smad3)結(jié)合并將R-Smads磷酸化,后者與Smad4形成異源寡聚復(fù)合物,進(jìn)入細(xì)胞核與特異的DNA結(jié)合,隨后發(fā)生轉(zhuǎn)錄反應(yīng),抑制上皮細(xì)胞增殖。Smad7位于染色體18q21.1上,介于MADR2與DPC4之間,兩者分別編碼Smad2和Smad4蛋白。該位點等位基因的丟失見于多種惡性疾病,并且與其預(yù)后差密切相關(guān)。Smad7表達(dá)的紊亂,可影響細(xì)胞對TGF-β的應(yīng)答,從而促進(jìn)細(xì)胞的惡性進(jìn)展。國內(nèi)外研究表明在多種類型腫瘤如乳腺癌、胃

3、癌、胰腺癌、前列腺癌等中都存在Smad7表達(dá)異常。目前對于在食管鱗癌是否存在Smad7表達(dá)異常,其在食管鱗癌中發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移中的作用是什么,國內(nèi)外研究尚少。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測食管鱗癌組織中Smad7、TβRⅡ、Smad3的表達(dá)及相關(guān)性;采用RT-PCR、western-blot檢測食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7siRNA前后Smad7、TβRⅡ、Smad3的表達(dá);采用倒置顯微鏡、MTT法、Boydenchamber體外

4、侵襲實驗檢測食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7 siRNA后細(xì)胞形態(tài)、增殖能力及體外侵襲能力的改變。
　　材料和方法：1.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測100例手術(shù)切除的食管鱗癌組織及其癌旁正常粘膜中Smad7、TβRⅡ和Smad3蛋白的表達(dá)情況。
　　2.采用RNA干擾技術(shù)使食管鱗癌細(xì)胞株EC-1中Smad7基因沉默,倒置顯微鏡觀察Smad7基因沉默后食管鱗癌細(xì)胞株EC-1形態(tài)學(xué)的變化。
　　3.采用RT-PCR、Wes

5、tern-blot法檢測食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7siRNA后24h、48h、72h Smad7、TβRⅡ、Smad3 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　4.采用MTT法檢測食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7 siRNA后24h、48h、72h細(xì)胞增殖能力改變。
　　5.采用Boyden chamber體外侵襲實驗檢測食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7siRNA后24h、48h、72h細(xì)胞體外侵襲力改變。
　　

6、6.統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)數(shù)據(jù)采用陽性率表示,陽性率之間的比較采用x~2檢驗(Chi-square),陽性率間相關(guān)性采用Kendall等級相關(guān)進(jìn)行比較;計量數(shù)據(jù)采用±S表示,兩組均數(shù)的比較用t檢驗(t-test),兩組以上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)。顯著性水平a=0.05。
　　結(jié)果：1.食管鱗癌組織中Smad7蛋白陽性表達(dá)率(80.0％)明顯高于正常食管黏膜(58.0％)(P<0.

7、01)。Smad7蛋白表達(dá)與浸潤深度有關(guān),其在深層浸潤組陽性表達(dá)率明顯(89.1％)高于淺層浸潤組(63.9％)(P<0.01);Smad7蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),其在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率(100％)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(74.4％)(P<0.05);Smad7蛋白表達(dá)與病理分級無關(guān)(P>0.05)。
　　2.食管鱗癌組織中TβRⅡ蛋白陽性表達(dá)率(42.0％)明顯低于正常食管黏膜(82.0％)(P<0.01)。TβRⅡ蛋白

8、表達(dá)與浸潤深度有關(guān),其在深層浸潤組陽性表達(dá)率明顯(37.5％)低于淺層浸潤組(50.0％)(P<0.05);Smad7蛋白表達(dá)與病理分級有關(guān),Ⅲ級陽性表達(dá)率(18.2％)明顯低于Ⅰ級陽性表達(dá)率(60.0％)(P<0.05);TβRⅡ蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),其在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率(18.2％)明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(48.7％)(P<0.05)。
　　3.食管鱗癌組織中Smad3蛋白陽性表達(dá)率(68.0％)明顯低于正常食管黏

9、膜87.0％)(P<0.01)。Smad3蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),其在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率(27.3％)明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(79.5％)(P<0.01);Smad3蛋白表達(dá)與浸潤深度和病理分級均無關(guān)(P>0.05)。
　　4.食管鱗癌組織中Smad7表達(dá)與TβRⅡ和Smad3均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);TβRⅡ表達(dá)與Smad3呈正相關(guān)(P<0.01)。
　　5.食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7 siRNA后,S

10、mad7siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)變圓,顆粒增多,呈立方形或橢圓形;而對照組細(xì)胞貼壁生長良好,細(xì)胞輪廓清楚,呈紡錘形或長梭形。
　　6.食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7 siRNA后RT-PCR結(jié)果顯示,各時間段(24h、48h、72h)Smad7siRNA轉(zhuǎn)染組Smad7mRNA的表達(dá)均顯著低于對照組(P<0.05),并隨時間延長逐漸降低(P<0.05);Smad7siRNA轉(zhuǎn)染后72h,Smad7siRNA組TβRⅡmRNA

11、的表達(dá)與細(xì)胞對照組,單純脂質(zhì)體組相比明顯升高(P<0.01);轉(zhuǎn)染后48h、72h,Smad7siRNA組Smad3 mRNA的表達(dá)與細(xì)胞對照組,單純脂質(zhì)體組相比明顯升高(P<0.05)。Smad7siRNA組,轉(zhuǎn)染后48 h、72 h與24 h比,Smad3 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。Smad7siRNA組,轉(zhuǎn)染后72 h與48 h比,Smad3 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。
　　7.食管鱗癌細(xì)胞株EC

12、-1轉(zhuǎn)染Smad7 siRNA后Western-blot結(jié)果顯示,各時間段(24h、48h、72h)Smad7siRNA轉(zhuǎn)染組Smad7蛋白的表達(dá)均顯著低于對照組(P<0.05),并隨時間延長逐漸降低(P<0.05)。Smad7siRNA轉(zhuǎn)染后72h,Smad7siRNA組TβRⅡ蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞對照組,單純脂質(zhì)體組相比升高明顯(P<0.01):Smad7siRNA轉(zhuǎn)染48h、72h,Smad7siRNA組Smad3蛋白的表達(dá)水平與

13、細(xì)胞對照組,單純脂質(zhì)體組相比明顯升高(P<0.05)。Smad7siRNA轉(zhuǎn)染后,Smad7siRNA組Smad3蛋白表達(dá)隨時間延長逐漸升高,48h、72h與24h比顯著升高(P<0.05)。
　　8.食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7 siRNA后MTT結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染48h、72h后Smad7siRNA組A值與單純脂質(zhì)體組,細(xì)胞對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)。
　　9.食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7 si

14、RNA后Boyden chamber體外侵襲實驗結(jié)果顯示,24h、48h、72h,Smad7siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組相比,穿越Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.食管鱗癌組織中Smad7蛋白表達(dá)增高,TβRⅡ蛋白、Smad3蛋白表達(dá)降低,且Smad7、TβRⅡ及Smad3蛋白在食管鱗癌組織中異常表達(dá)與病理學(xué)特征密切相關(guān),提示這三種蛋白表達(dá)異常與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。
　　2.

15、食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7 siRNA后,下調(diào)細(xì)胞Smad7mRNA及蛋白的表達(dá),成功沉默Smad7表達(dá),且其抑制作用具有特異性和時間依賴性。為食管鱗癌中針對Smad7的腫瘤基因治療提供了新的策略和技術(shù)平臺。
　　3.食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Smad7 siRNA后,細(xì)胞增殖受到抑制,細(xì)胞體外侵襲能力降低。提示Smad7 siRNA能夠有效抑制食管癌的惡性進(jìn)展,Smad7可望作為輔助治療靶點在食管癌治療中發(fā)揮作用。