苦參堿對(duì)人食管癌細(xì)胞株Eca-109增殖和凋亡的影響.pdf

1、食管癌(carcinoma of the esophagus)是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,它嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。全世界每年有20余萬(wàn)人死于食管癌,我國(guó)每年死亡達(dá)15萬(wàn)人,占據(jù)世界食管癌死亡人數(shù)的大部分。在我國(guó),食管癌發(fā)病率男性居各種惡性腫瘤第四位,女性為第七位,而死亡率男女均居第四位。食管癌的發(fā)病率有明顯的地區(qū)差異,高發(fā)地區(qū)食管癌的發(fā)病率可高達(dá)150/10萬(wàn)以上,低發(fā)地區(qū)則只有3/10萬(wàn)左右。國(guó)外以中亞、非洲、法國(guó)北部和中南美洲為高

2、發(fā)區(qū),我國(guó)以太行山地區(qū)、秦嶺東部地區(qū)、大別山區(qū)、四川北部地區(qū)、閩南和廣東潮汕地區(qū)、蘇北地區(qū)為高發(fā)區(qū)。其中河南林縣,食管癌死亡率男性為161.33/10萬(wàn),女性為102.88/10萬(wàn),其死亡率居各種惡性腫瘤首位[1]。盡管?chē)?guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者經(jīng)過(guò)幾十年的探索實(shí)踐,在食管癌的防治方面取得很大的成績(jī),但食管癌的具體發(fā)病機(jī)制仍然不十分清楚,以手術(shù)、化療、放療為主的綜合治療手段仍不盡如人意,尤其在藥物治療方面,食管癌對(duì)化療藥物敏感性很差,化療效果有限

3、。食管癌的預(yù)后仍較差,雖然早期食管癌術(shù)后五年生存率可高達(dá)80％-95％,但中晚期病人僅為1096左右,后者也正是臨床最多見(jiàn)的[2]。如果能開(kāi)發(fā)出一種新的、效果明顯的食管癌化療藥物或者新的輔助化療藥物以減輕化療副作用,則可有望提高食管癌患者的生存率和生存質(zhì)量,造福廣大食管癌患者。
　　 苦參堿(Matrine MA)是傳統(tǒng)中藥苦參根提純的化學(xué)單體之一,廣泛存在于豆科槐屬苦參、苦豆子及廣豆根中,在我國(guó)有豐富的資源,它是白金雀兒堿(l

4、upanine)的異構(gòu)體,屬于四環(huán)的喹諾里西啶類(lèi)(quinolizidine),分子式:C15H24N2O分子量:248.37,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下圖。多年來(lái)對(duì)其大量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn),MA具有免疫抑制[3]、抗炎、抗肝纖維化[4]、抗心律失常[5]等多種藥理作用。廣泛應(yīng)用于臨床各科,具有長(zhǎng)效、持久、副作用少等特點(diǎn),容易為廣大患者所接受,新近的研究發(fā)現(xiàn),該藥還具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)其凋亡等生物活性[4,5]。研究證實(shí),MA對(duì)肝癌、肺

5、癌、胃癌及前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。文獻(xiàn)報(bào)道,一定濃度的苦參堿在體外可誘導(dǎo)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞凋亡,且其誘導(dǎo)凋亡的作用隨苦參堿的濃度增加而增加[6]。體外0.8g/L苦參堿處理3d就能明顯抑制人肝癌細(xì)胞株(HepG2)的增殖,1.5g/L可明顯誘導(dǎo)其凋亡[7]。有研究提示苦參堿可克服腫瘤的多藥耐藥現(xiàn)象,有可能成為一種理想的中藥抗腫瘤制劑[8]。還有的學(xué)者試圖從基因水平來(lái)闡述苦參堿對(duì)白

6、血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用的機(jī)制,認(rèn)為從中藥和天然藥物中尋找和提取誘導(dǎo)分化劑來(lái)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化治療可能是一種新的抗腫瘤治療途徑[9]。有研究表明,苦參堿可明顯抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附后CD44、CD49粘附因子的表達(dá),從而抑制了腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,減少了腫瘤的轉(zhuǎn)移[10]。王涌等[11]訂研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可上調(diào)細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)基因CARmRNA在人肝癌細(xì)胞系Bel-7404中的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,最終降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移

7、能力,可能是苦參堿誘導(dǎo)分化的重要機(jī)制:另外,對(duì)腫瘤細(xì)胞周期變化的影響也是苦參堿誘導(dǎo)分化的可能機(jī)制之一。林洪生等[12]研究表明,一定濃度苦參堿可明顯抑制Tiaml基因的表達(dá),通過(guò)這種控作用可以降低腫瘤細(xì)胞的粘附和遷移,從而對(duì)一些腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生一定的抑制作用。雖然苦參堿對(duì)肺腺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、白血病細(xì)胞的體外抑制作用都有相應(yīng)的研究,并有部分闡述了一定的分子機(jī)制,但是苦參堿對(duì)食管癌細(xì)胞的抑制作用研究以及分子機(jī)制的探討在

8、國(guó)內(nèi)卻并不多見(jiàn),氧化苦參堿對(duì)食管癌細(xì)胞的作用研究相對(duì)多一些。
　　 本論文以人食管癌細(xì)胞株(Eca-109)為研究對(duì)象,采用MTT比色法、Hoechst33342染色法以及流式細(xì)胞分析來(lái)探討中藥提取物苦參堿單體對(duì)Eca-109的誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖作用。首先采用MTT法分別測(cè)定Eca-109經(jīng)不同濃度苦參堿(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/ml)處理24 h和經(jīng)固定濃度苦參堿(2.0 mg/ml)處理不同時(shí)間(0、12

9、、24、36、48 h)后的細(xì)胞增殖存活率。結(jié)果表明,苦參堿在體外對(duì)Eca-109具有明顯的存活抑制作用,它們的增殖存活率與苦參堿呈劑量一時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。隨著苦參堿的濃度增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng),其對(duì)Eca-109的抑制增殖作用越強(qiáng),細(xì)胞增殖存活率越低。為了探討苦參堿是否具有誘導(dǎo)Eca-109發(fā)生凋亡的能力,我們采用Hoechst33342染色后經(jīng)熒光顯微鏡觀察和Annexin V/PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)相結(jié)合的方法,研究證實(shí)苦參堿可以有效

10、誘導(dǎo)Eca-109發(fā)生凋亡,而且凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨苦參堿處理時(shí)間和作用濃度的增加而增加,表現(xiàn)出明顯的時(shí)間-劑量依賴(lài)關(guān)系。同時(shí),我們還采用PI單染經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法,研究證實(shí)苦參堿可以有效誘導(dǎo)Eca-109發(fā)生細(xì)胞周期G2期阻滯。
　　 綜上所述,本論文的研究結(jié)果證實(shí)了苦參堿具有抑制Eca-109存活增殖及誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的能力,以及苦參堿誘導(dǎo)Eca-109發(fā)生細(xì)胞周期G2期阻滯,表明苦參堿抑制Eca-109細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)其發(fā)生凋