人食管癌Eca-109細胞膜抗原篩選的初步研究.pdf

1、鄭州大學碩士學位論文人食管癌Eca109細胞膜抗原篩選的初步研究姓名：孫濤申請學位級別：碩士專業(yè)：病理與病理生理學指導教師：董子明趙明耀20030520鄭州人學2003脯壩J研究生畢業(yè)論義人食管痛Eca109細胞膜抗原篩選的初步研究(即mg去垢FIJ／mg膜蛋門)。3以超濾法純化膜蛋白并分組：以超濾法將膜蛋白從以TritonX一100作去垢劑的成分中按分子量大小分出100KDa兩個絹，并測定各組膜蛋白濃度。4檢測Eca一109細胞的HL

2、A表型及篩選健康志愿者：使用HLA引物試劑盒，瓊脂糖凝膠電泳(agarosegelelectrophoresis)觀察聚合酶鏈反1、’V(polymerasechainreaction，PCR)擴增后的DNA產(chǎn)物，用擴增產(chǎn)物的有無鑒定出Eca109細胞的HLA表型。采用血清學HLA分型技術，尋找至少有。個位點與Eta109細胞HLA相匹配的健康志愿者。5人外周向DC的培養(yǎng)：取篩選卅的志愿者的外周血，密度梯度離心法獲得外周血單個核jJ包(

3、peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，用含粒細胞巨噬細胞集落刺激[]子(granulocyte—macrophagecolonystimulatingfactor，GM—CSF)、白細胞介素4(interleukin一4，IL一4)及該志愿者血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度后，加入24孔板中培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第4天，根據(jù)一定比例加入膜蛋白及hTNF—a刺激DC成熟，于第10天收獲成熟的懸浮DC。

4、6人外周J：fILT細胞的培養(yǎng)：在IL2維持下，流式細胞儀檢測此志愿者PBMC的分化情況。根據(jù)檢測結果，再提取PBMC，經(jīng)過換培養(yǎng)瓶及PHA刺激，以含hIL一2的RPMI一1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)PBMC4周，收集純化的T細胞。7，MTT法測定致敏T細胞的細胞毒活性：以純化的T細胞為效慮細胞，加入負載抗原的成熟DC，以8：l、16：1、32：1的效靶比分別加入Eca一109細胞(其為靶細胞)；同時設陽性對照組、陰性對照組及效應對照組，各組

5、設3個復孔，用MTT法在96孔板中測定CTL的細胞毒活性。結果1在pH63的條件下，適當?shù)娜ス竸┡c膜蛋白之比(IIImg去垢齊l／mg膜蛋白)，在使用辛基13一葡糖苷時為6：1；使用TritonX一100時為2：1。2Eca109細胞的HLA的基因分型為A03，A24；B35，B’37：DRBlDRBl’12；DRB3。并找到一例表型為A03雜合了的健康志愿者。3PBMC的分化情況：健康人PBMC，只在IL2維持下，用流式細胞儀檢測其分