食管癌細(xì)胞系Eca-109放射前后的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的： 應(yīng)用MTT法和流式細(xì)胞儀探討食管癌細(xì)胞系Eca-109的放射生物學(xué)特點(diǎn)。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分析Eca-109細(xì)胞X線照射前后的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，以進(jìn)一步研究食管癌放射治療的機(jī)制，尋找輻射殺傷腫瘤細(xì)胞新的分子靶點(diǎn)及如何增加輻射敏感性的分子機(jī)制，為腫瘤放射治療臨床應(yīng)用研究奠定理論基礎(chǔ)。 方法： 第一部分：應(yīng)用MTT法繪制食管癌細(xì)胞系Eca-109不同劑量照射的細(xì)胞生長曲線。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測不同劑量照射的Ec

2、a-109的細(xì)胞周期變化及凋亡情況，對其進(jìn)行放射生物學(xué)研究。 第二部分：實(shí)驗(yàn)主要利用雙向電泳，對Eca-109細(xì)胞4Gy-X線照射前后的細(xì)胞進(jìn)行蛋白分離。雙向凝膠電泳的第一向電泳采用固相pH梯度電泳，第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。電泳后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，PDQuest雙向凝膠電泳軟件分析，并結(jié)合人工比對篩選X線照射前后凝膠中相對含量的比值大于2的差異蛋白點(diǎn)，將有意義的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)膠內(nèi)胰蛋白酶解，為后續(xù)質(zhì)譜分析奠定基礎(chǔ)

3、。 第三部分：實(shí)驗(yàn)對雙向電泳分離出的、凝膠圖像PDQuest軟件分析并結(jié)合人工比對選定的21個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)，通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF-MS)技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定分析。對得到的肽質(zhì)量指紋圖譜和部分肽段氨基酸序列結(jié)合其等電點(diǎn)、分子量、物種來源、修飾情況等參數(shù)在Mascot蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索，進(jìn)行蛋白的鑒定。生物信息學(xué)分析應(yīng)用互聯(lián)網(wǎng)上基因本體論(GeneOntology)和京都基因與基因組百科

4、全書(KEGG)信息資源，結(jié)合人工檢索文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫，對蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行深入分析。 結(jié)果： 1.Eca-109細(xì)胞的放射生物學(xué)特點(diǎn)：2、4、6、8Gy4組細(xì)胞生長抑制率分別為32.81％、35.65％、49.48％、87.13％，劑量越大細(xì)胞生長抑制越明顯。X射線照射可引起Eca-109細(xì)胞的細(xì)胞周期變化，表現(xiàn)為隨照射劑量增大S期細(xì)胞比例降低，而G2/M期細(xì)胞比例增多，G1期細(xì)胞比例變化不明現(xiàn)。AnnexinV/PI雙染法檢

5、測細(xì)胞凋亡情況，0、2、4、6、8Gy組的凋亡率分別為0.53％、0.73％、0.77％、0.88％、1.26％。雖然隨著劑量增加凋亡率隨之升高，但Eca-109細(xì)胞在8Gy劑量內(nèi)，各組細(xì)胞凋亡比例均較小。 2.成功獲得Eca109細(xì)胞的4Gy-X線照射前后的雙向電泳圖，經(jīng)PDQuest軟件分析掃描后的圖像，4Gy-X線照射組中檢測到蛋白點(diǎn)388個(gè)，未照射組蛋白點(diǎn)339個(gè)，匹配率為87.37％。結(jié)合人工比對兩組間表達(dá)差異的點(diǎn)主要

6、分布于pI4.7-8.9之間，相對分子質(zhì)量(Mr)在13-100kD區(qū)域。兩組凝膠匹配點(diǎn)相對含量的比值大于2或小于0.5者認(rèn)為存在差異，選擇符合此條件的差異點(diǎn)21個(gè)，在照射組中有16個(gè)蛋白高表達(dá)，其中11個(gè)蛋白在未照射組中表達(dá)缺失，5個(gè)蛋白表達(dá)在2倍以上：未照射組中有5個(gè)高表達(dá)，其中2個(gè)蛋白在照射組中表達(dá)缺失，3個(gè)蛋白表達(dá)在2倍以上。 3.利用MALDI-TOF/TOF-MS串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索對上述21個(gè)差異蛋白點(diǎn)

7、進(jìn)行鑒定，MASCOT軟件搜索Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫，得到符合條件的Eca-109細(xì)胞4Gy-X線照射前后的差異表達(dá)蛋白14個(gè)。運(yùn)用蛋白數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫檢索，對上述14種蛋白進(jìn)行相關(guān)信息的匯總分析，分別為細(xì)胞角蛋白-18、Y14蛋白、hnRNPC、hnRNPA2/B1、HSP70、HSP60、鈣網(wǎng)織蛋白、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3、Actin-3、Cofilin-1、Lamin-A/C、Actin-relatedprotein3和鳥氨

8、酸氨基轉(zhuǎn)移酶。除Cofilin-1和角蛋白-18在照射組低表達(dá)，其余蛋白均在照射組高表達(dá)。對上述14種蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分析、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫和查閱相關(guān)文獻(xiàn)分析，結(jié)果大多數(shù)的蛋白在分子功能注解中表現(xiàn)為結(jié)合活性，在生物學(xué)功能方面主要與凋亡調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控、RNA轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架組成和輻射應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)。與KEGG中的生物通路相比較，多數(shù)蛋白質(zhì)通過與通路中某些分子的相互作用而間接參與其中。 結(jié)論： 1.Eca

9、-109細(xì)胞的放射生物學(xué)特點(diǎn)：細(xì)胞生長抑制與X射線照射劑量呈正相關(guān)。X射線照射引起細(xì)胞周期變化，主要表現(xiàn)為隨照射劑量增大S期細(xì)胞比例降低，而G2/M期細(xì)胞比例增多。X射線照射在8Gy劑量以內(nèi)，各組細(xì)胞凋亡比例均較小，提示通過干預(yù)提高細(xì)胞凋亡率可能提高該細(xì)胞的放射敏感性。 2.根據(jù)蛋白質(zhì)不同的分子量和等電點(diǎn)，通過雙向凝膠電泳技術(shù)可很好的進(jìn)行蛋白質(zhì)成分分離，并利用分析軟件獲得Eca-109細(xì)胞4Gy-X線照射前后的差異蛋白質(zhì)。