HaCaT細(xì)胞系與皮膚鱗癌細(xì)胞系SCL-1蛋白質(zhì)組差異分析的研究.pdf

1、HaCaT細(xì)胞系與皮膚鱗癌細(xì)胞系SCL-1蛋白質(zhì)組差異分析的研究皮膚鱗狀細(xì)胞癌簡(jiǎn)稱皮膚鱗癌，起源于表皮和皮膚附屬器的角質(zhì)形成細(xì)胞，是侵襲性癌，其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不十分清楚。HaCaT細(xì)胞系源于人類表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞，SCL-1細(xì)胞系源于人皮膚鱗狀細(xì)胞癌的瘤細(xì)胞，因而它們分別是研究人類表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)的理想模型。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)可以高通量發(fā)現(xiàn)不同組織細(xì)胞間蛋白質(zhì)的變化，而且可以通過特異性的差異蛋白作為疾病診斷治

2、療的分子標(biāo)記。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)核心技術(shù)雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)，分析和鑒定HaCaT細(xì)胞系和SCL-1細(xì)胞系的差異蛋白，為闡明皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制并為其診斷治療提供依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.HaCaT細(xì)胞系與SCL-1細(xì)胞系蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的建立及其差異分析 1.1細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5％CO2條件下，用含10％胎牛血清的RPMl1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL)分別培養(yǎng)HaCa

3、T細(xì)胞和SCL-1細(xì)胞于75cm2培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化，分別收集HaCaT細(xì)胞和SCL-1細(xì)胞后，室溫下PBS液沖洗、1000 r/min離心三次,收集細(xì)胞-70℃凍存或立即用于樣品制備。 1.2制備蛋白質(zhì)樣品將收集到的細(xì)胞與裂解液按1:5體積的比例混勻，冰浴靜止反應(yīng)一小時(shí)后，12000 r/min、15℃離心1h，收集上清液，Bradford法測(cè)定其蛋白濃度，分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?

4、1.3等電聚焦使用17cm(pH 3-10L，pH 4-7L，pH 5-8L)IPG膠條，在PROTEANIEF等電聚焦儀上聚焦，上樣量為1.2mg，上樣體積為350ul。 50V，20℃主動(dòng)水化13h；250V線性升壓30min、1 000V快速升壓1h；10 000V線性升壓5h;10 000V快速升壓60 000Vh。每根膠條的極限電流為50μA，等電聚焦的溫度為20℃。 1.4平衡與SDS-PAGE電泳經(jīng)兩步平衡后SDS

5、-PAGE電泳，30v 30min，加壓至120v，直到溴酚藍(lán)泳至玻璃板前緣0.5cm止。 1.5染色和圖像分析考馬斯亮蘭染色后，利用Image Master 2D 4.10軟件對(duì)HaCaT細(xì)胞與SCL-1細(xì)胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)差異分析。 1.6選擇清晰匹配差異點(diǎn)手工切取后進(jìn)行質(zhì)譜分析 2.HaCaT細(xì)胞系與SCL-1細(xì)胞系差異蛋白鑒定分析 2.1蛋白質(zhì)組差異分析重點(diǎn)分析HaCaT細(xì)胞系與

6、SCL-1細(xì)胞系高差異蛋白 2.2選取12個(gè)差異點(diǎn)作質(zhì)譜測(cè)定選取原則是：可重復(fù)，非邊緣化，斑點(diǎn)清楚，匹配關(guān)系肯定，肉眼可見。所獲質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，再綜合表觀分子量、等電點(diǎn)判定結(jié)果。先將考染蛋白樣品酶解，然后提取肽段，再在N2下吹干濃縮，最后進(jìn)行MALDI-TOP-TOF MS蛋白鑒定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.建立了HaCaT細(xì)胞系和SCL-1細(xì)胞系蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜。 2.在pH 4-7L IPG膠條上，

7、HaCaT.細(xì)胞系和SCL-1細(xì)胞系中分別檢測(cè)到(690±39)個(gè)和(665±31)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中匹配的蛋白點(diǎn)為396±34)個(gè)，三張同一樣本(HaCaT細(xì)胞系及SCL-1細(xì)胞系蛋白質(zhì)樣本)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)匹配率分別為72.6％和71.9％。 3.對(duì)表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，初步鑒定在HaCaT細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)的蛋白是：prohibitin；dUTP焦磷酸酶；chain B，the 2.1 a structur

8、e of a tumour suppressing serpin；eukaryofie translation initia-don factor 3，subunit 2 beta；sfrsl protein。在SCL-1細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)的蛋白是：原肌球蛋白-4，熱休克蛋白-27，磷酸丙糖異構(gòu)酶；ICRTHB1；chainB，X-ray crystal structure of human galectin-1 。 結(jié)論：獲得了