VEGF-C和VEGFR-3在食管鱗癌中的表達(dá)及其siRNA抗淋巴管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、淋巴道轉(zhuǎn)移是惡性實(shí)體瘤、特別是上皮源性的惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移主要途徑，也是惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因。探討腫瘤淋巴管形成與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系不僅具有重要的理論意義，而且抗腫瘤淋巴管生成也可望成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的新治療靶點(diǎn)。 食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類的生命及健康。食管癌的發(fā)病機(jī)制迄今尚不完全明確。由于食管癌的早期臨床癥狀不甚明顯，故多數(shù)患者在確診時(shí)已達(dá)癌癥的中晚期，且多發(fā)生了淋巴道轉(zhuǎn)移，治療效果往往欠佳。因此，探討食管

2、癌淋巴管生成與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并研究以抗淋巴管生成為靶點(diǎn)，進(jìn)而阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，具有十分重要臨床意義及應(yīng)用前景。 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)及其受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)，亦稱Flt-4，是近年來發(fā)現(xiàn)的淋巴管生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)淋巴管生成方

3、面起十分重要的作用。 VEGFR-3屬于內(nèi)皮受體型酪氨酸蛋白激酶，由芬蘭學(xué)者Paiusola等在1992年從人的胚胎和白血病細(xì)胞cDNA文庫中克隆得到，位于第5號(hào)染色體長(zhǎng)臂5q33～q35區(qū)帶上，是一個(gè)高度糖基化的單鏈跨膜蛋白，其分子量為180 kD。在胚胎期是胚胎血管形成的必需因素，在血管及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞均有分布，而在成人則僅于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。VEGF-C是1996年芬蘭學(xué)者Pajusola和Joukov等從人類前列腺癌

4、細(xì)胞株P(guān)C-3的cDNA文庫中克隆并分離出來的一種分泌型糖蛋白，它是VEGFR-3的配體，與VEGF(亦稱VEGF-A)享有同源區(qū)域。人VEGF-C基因位于染色體4q34上，編碼產(chǎn)物為419個(gè)氨基酸殘基的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為4.69kD，可在正常人體心臟、胎盤和肌肉等組織中有弱表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中呈較強(qiáng)陽性表達(dá)。 近年來，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的基因治療提供了一種新的思路。通過

5、RNAi技術(shù)抑制癌基因的表達(dá)，有可能成為腫瘤基因治療的新策略，具有較好的應(yīng)用前景。由于該技術(shù)具有高效性和高度特異性，既能高效、特異地阻斷目的基因的表達(dá)，而對(duì)其他正?；驘o影響。因此RNAi技術(shù)已成為當(dāng)前研究基因功能的、病毒感染性疾病、遺傳性疾病及腫瘤基因治療等方面新的技術(shù)手段。 為了探討VEGF-C和VEGFR-3在食管鱗癌組織中的表達(dá)，并從體內(nèi)、外兩個(gè)方面采用RNAi技術(shù)，探究抗腫瘤淋巴管生成在腫瘤基因治療中的意義，本研究進(jìn)行

6、了以下系統(tǒng)性研究。采用免疫組織化學(xué)、RT-PCR、原位雜交(in situ hybridization，ISH)等技術(shù)，分別檢測(cè)49例高發(fā)地區(qū)食管鱗癌組織、23例癌旁不典型增生組織及49例正常黏膜中VEGF-C和VEGFR-3的表達(dá)程度，探討食管癌中VEGF-C及其受體與淋巴管生成的相關(guān)性；應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)人食管癌EC9706細(xì)胞VEGF-C mRNA表達(dá)，并根據(jù)VEGF-C在人食管癌EC9706細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn)，采用RNA干擾技術(shù)，

7、自行構(gòu)建針對(duì)VEGF-C的DSINsi-U6-siRNA真核表達(dá)載體，應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)，將其成功轉(zhuǎn)染導(dǎo)入EC9706細(xì)胞。進(jìn)而應(yīng)用免疫組化、RT-PCR、ISH和流式細(xì)胞技術(shù)等技術(shù)，觀察轉(zhuǎn)染了siRNA質(zhì)粒的人食管癌EC9706細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期變化及VEGF-C表達(dá)，從體外實(shí)驗(yàn)的角度觀察siRNA對(duì)EC9706細(xì)胞中VEGF-C表達(dá)水平的抑制作用；在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建裸鼠人食管癌移植瘤動(dòng)物模型，將轉(zhuǎn)染了針

8、對(duì)VEGF-C的siRNA表達(dá)載體的EC9706細(xì)胞種植于裸鼠皮下，形成人食管癌EC9706細(xì)胞移植瘤，觀察移植瘤的生長(zhǎng)變化，并應(yīng)用免疫組化、RT-PCR和ISH等技術(shù)，分別檢測(cè)移植瘤組織中VEGF-C表達(dá)水平，從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的角度驗(yàn)證移植瘤組織中VEGF-C表達(dá)的抑制作用。通過以上實(shí)驗(yàn)，試圖闡明VEGF-C和VEGFR-3在人食管鱗癌的表達(dá)特征；發(fā)現(xiàn)人食管癌EC9706細(xì)胞系中VEGF-C基因表達(dá)情況；進(jìn)一步探討采用特異性RNAi抑制VE

9、GF-C基因后，EC9706細(xì)胞中VEGF-C基因表達(dá)特點(diǎn)與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等變化，以及RNAi抑制VEGF-C基因表達(dá)后在整體水平對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)、VEGF-C基因表達(dá)等的影響，為進(jìn)一步了解VEGF-C基因在食管癌發(fā)展中的作用，并為食管癌抗淋巴管生成治療，提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 本研究分為以下三個(gè)部分： 第一部分人食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜中VEGF-C及其受體VEGFR-3表

10、達(dá)的研究 方法 1、采用免疫組化SP(Streptavidin-Peroxidase)法檢測(cè)49例高發(fā)區(qū)食管鱗癌組織、23例癌旁不典型增生組織及49例正常黏膜中VEGF-C和VEGFR-3蛋白的表達(dá)。 2、采用ISH和RT-PCR技術(shù)對(duì)49例高發(fā)區(qū)食管鱗癌組織、23例癌旁不典型增生組織及49例正常黏膜中VEGF-C和VEGFR-3 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。 3、采用免疫組化和雙重酶組織化學(xué)技術(shù)對(duì)食管癌組

11、織及癌旁組織中的淋巴管密度進(jìn)行檢測(cè)。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料計(jì)算陽性率，計(jì)量資料用采用X±S表示；陽性率之間的比較采用X<'2>(chi-square)及 Fisher確定概率計(jì)算法；等級(jí)相關(guān)資料采用秩和檢驗(yàn)；兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)(t-test)；兩組以上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 第二部分 RNA干擾對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞中VEGF-

12、C蛋白和mRNA體外表達(dá)的影響研究 方法 1、設(shè)計(jì)合成針對(duì)VEGF-C基因的編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈(HX1、HX2和HX3)及與人所有基因都不同源的對(duì)照寡核苷酸(HX4)，構(gòu)建真核表達(dá)載體pSINsi-U6-HX1、pSINsi-U6-HX2、pSINsi-U6-HX3和pSINsi-U6-HX4。 2、將表達(dá)載體pSINsi-U6-HX1、pSINsi-U6-HX2、pSINsi-U6-HX3和pSI

13、Nsi-U6-HX4及控制組空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞。 3、采用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)及Boyden chamber侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)篩選后陽性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖、周期和細(xì)胞侵襲能力的變化。 4、采用免疫組化、原位雜交和RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后食管癌EC9706細(xì)胞VEGF-C蛋白及mRNA的表達(dá)。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料計(jì)算陽性率，計(jì)量資料用采用x±s表示

14、；陽性率之間的比較采用X<'2>及Fisher確定概率計(jì)算法；等級(jí)相關(guān)資料采用秩和檢驗(yàn)；兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)；兩組以上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 第三部分 RNA 干擾對(duì)食管癌EC9706 細(xì)胞在裸鼠食管癌移植瘤中VEGF-C蛋白和mRNA體內(nèi)表達(dá)的影響研究 方法 1、SPF環(huán)境飼養(yǎng)裸小鼠，將正常食管癌EC9706細(xì)胞及轉(zhuǎn)染VEGF-C siRNA后的各組細(xì)胞分別注射入實(shí)驗(yàn)裸鼠腹

15、側(cè)腋窩皮下，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。 2、觀察各組裸鼠的生長(zhǎng)情況以及移植瘤的重量和體積。 3、采用免疫組化、原位雜交和RT-PCR技術(shù)，觀察各組移植瘤組織中VEGF-C蛋白和mRNA表達(dá)。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料計(jì)算陽性率，計(jì)量資料用采用x±s表示；陽性率之間的比較采用X<'2>及Fisher確定概率計(jì)算法；等級(jí)相關(guān)資料采用秩和檢驗(yàn)；兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)；兩組

16、以上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)論 1、檢測(cè)食管癌高發(fā)區(qū)食管鱗癌組織中VEGF-C和VEGFR-3在蛋白水平及mRNA水平均呈高表達(dá)，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，并且該二種基因表達(dá)具有相關(guān)性，為食管癌抗淋巴管生成治療提供了新靶點(diǎn)。 2、聯(lián)合應(yīng)用免疫組化和酶組織化學(xué)技術(shù)(5’-核苷酸酶-堿性磷酸酶雙重染色法)檢測(cè)食管癌組織及癌旁間質(zhì)組織中淋巴管密度，證明了食管癌組織中有新生淋巴管形

17、成，且癌周淋巴管密度高于癌組織，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。 3、首次應(yīng)用RNAi技術(shù)，構(gòu)建了3個(gè)針對(duì)VEGF-C特異性pSINsi-U6 siRNA真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞，經(jīng)藥物篩選獲得穩(wěn)定陽性克隆。經(jīng)RT-PCR、原位雜交和免疫組化技術(shù)證實(shí)在mRNA和蛋白水平VEGF-C表達(dá)顯著下降，VEGF-CRNAi可抑制VEGF-C基因的體外表達(dá)。 4、將轉(zhuǎn)染了pSINsi-U6 siRNA的食管癌EC9706細(xì)