轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞修飾血管內(nèi)支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、冠狀動(dòng)脈內(nèi)植入支架已成為治療冠心病的重要手段。然而,支架植入不能抑制新生內(nèi)膜增生,支架內(nèi)再狹窄(In-stent restenosis, ISR)的發(fā)生率仍有(13-20)％。目前,防治支架內(nèi)再狹窄的研究熱點(diǎn)在于藥物洗脫性支架,而該支架植入后出現(xiàn)的一些問(wèn)題已引起廣泛關(guān)注:如晚期支架血栓形成,支架涂層材料的不良病理作用,內(nèi)皮化延遲、動(dòng)脈瘤、支架貼壁不全等。促進(jìn)損傷血管愈合、加速支架完全再內(nèi)皮化過(guò)程是解決問(wèn)題的一條有效途徑。因此,內(nèi)皮細(xì)胞(

2、Endothelial Cell, EC)在再狹窄形成過(guò)程中的作用越來(lái)越受到重視。內(nèi)皮細(xì)胞移植能替代、修復(fù)受損內(nèi)皮的功能并抑制內(nèi)膜過(guò)度增生。體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞由于生長(zhǎng)環(huán)境的改變,導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢和其他生物特性的丟失,結(jié)合基因治療,有望通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)因子,提升細(xì)胞的增殖能力;結(jié)合動(dòng)態(tài)培養(yǎng),有望促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在血管內(nèi)支架表面的粘附和生長(zhǎng);結(jié)合模擬體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn),有望控制細(xì)胞支架在輸送過(guò)程中的損耗,保障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠

3、性。本研究就是基于上述思路開(kāi)展的應(yīng)用基礎(chǔ)研究,即轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞支架的初期研究。在本課題研究研究中,采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTAP對(duì)傳代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF121;并以此轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)并制作了用于血管內(nèi)支架表面種植細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置,通過(guò)對(duì)旋轉(zhuǎn)速度、旋轉(zhuǎn)時(shí)間、細(xì)胞種植密度和重復(fù)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)這些影響因素的分析,尋找出了粘附效果最好的條件組合;用超聲霧化噴涂法方法制備用于細(xì)胞粘附的蛋白涂層,并用掃描

4、電鏡和能譜測(cè)試儀檢測(cè)制備好的蛋白涂層;根據(jù)得到的最佳旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)條件制備轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞包被支架,通過(guò)掃描電鏡檢測(cè),旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)后血管內(nèi)支架表面粘附的細(xì)胞數(shù)量和鋪展情況,免疫熒光檢測(cè)支架表面粘附的細(xì)胞表達(dá)VEGF蛋白的情況;體外流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)過(guò)傳輸?shù)膿p耗和流動(dòng)剪切力的作用后,轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞在血管內(nèi)支架表面的粘附和生長(zhǎng)情況;最后通過(guò)兔腹主動(dòng)脈支架植入術(shù)的動(dòng)物模型檢測(cè)轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞包被支架的在體抗再狹窄和抗血栓的效果。研究結(jié)果如下:1)通過(guò)RT-P

5、CR和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,成功建立轉(zhuǎn)VEGF基因人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系;2)通過(guò)對(duì)旋轉(zhuǎn)速度、旋轉(zhuǎn)時(shí)間、細(xì)胞種植密度和重復(fù)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)這些影響因素的分析,尋找出了粘附效果最好的條件組合,當(dāng)細(xì)胞種植密度為1×105cells/ml,旋轉(zhuǎn)時(shí)間為6h,旋轉(zhuǎn)速度為0.4rpm時(shí),旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)粘附的細(xì)胞數(shù)量最多;3)制備明膠濃度為2-6mg/ml,多聚賴氨酸為10μg/ml的混合溶液,用超聲霧化噴涂法方法得到的蛋白涂層經(jīng)檢測(cè)在支架表面涂覆緊密、均勻;4)通過(guò)優(yōu)

6、化的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)條件制備出轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋的血管內(nèi)支架,在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下觀察,細(xì)胞在支架表面粘附生長(zhǎng),熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞高表達(dá)VEGF蛋白;5)體外流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞在模擬體內(nèi)傳輸過(guò)程中,將有部分細(xì)胞損失,但是在不同的切應(yīng)力作用下,轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細(xì)胞又很快的恢復(fù)生長(zhǎng);6)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與兩個(gè)對(duì)照組相比,細(xì)胞包被支架均極顯著的抑制了內(nèi)膜增生和降低了支架內(nèi)再狹窄。綜上所述,本研究初步解決了血管內(nèi)支架的細(xì)胞種植方法,提出一