鼻咽纖維血管瘤血管內皮細胞比正常血管內皮細胞具有更強的遷移和侵襲能力.pdf

1、鼻咽纖維血管瘤,又稱青少年鼻咽纖維血管瘤(juyenile nasopharyngeal angiofibroma,JNA)是鼻咽部良性腫瘤中最常見的一種,約占總頭頸部腫瘤的0.5％,主要發(fā)生于14-25歲的青少年男性。盡管JNA組織學上呈良性表型,但其沒有包膜,而且具有局部侵襲和破壞性惡性表型,可以累及鼻腔、鼻咽部、鼻竇、翼腭窩、顳下窩、翼突以及前顱底組織等。
　　JNA沒有特異性的藥物治療手段,放射療法的使用尚存在爭議,外科手

2、術切除仍然是目前最常用的治療方法。近年來,隨著耳鼻喉科臨床治療手段的長足進步,特別是術前栓塞和鼻內鏡技術的使用,使得大部分患者獲得了較好的預后,但是JNA術后高復發(fā)率(可高達5096)仍是一個極大的挑戰(zhàn)。目前關于JNA術后高復發(fā)的原因和相關的臨床預測指標研究甚少,可能與JNA向周圍顱底骨質侵襲,手術難以徹底切除有關。如能闡明引起JNA局部侵襲及術后復發(fā)的因素及其分子調節(jié)機制,將進一步改善JNA患者的預后。
　　腫瘤血管生成與包括J

3、NA在內的多種腫瘤生長和局部侵襲密切相關。但是目前基于JNA血管生成及其分子機制研究不多,特別是針對內皮細胞本身的功能研究更少,關鍵在于缺乏直接來源于腫瘤標本并可用于體外培養(yǎng)的血管內皮工具細胞。本課題首先分析血管內皮標記物CD105在JNA組織芯片(tissuemicroarray,TMA)微血管內皮細胞中的表達及其臨床意義,進一步通過免疫磁珠分選(magnetic activated cell sorting,MACS)人JNA的血管

4、內皮細胞進行傳代培養(yǎng),檢測腫瘤血管內皮細胞及正常血管內皮細胞間的功能差異并探討其差異的分子機制,以期闡明導致JNA高復發(fā)的原因及可能機制,并以此尋找新的復發(fā)干預途徑,進一步提高療效。
　　第一部分，血管內皮標記物CD105在鼻咽纖維血管瘤組織芯片微血管中的表達及其臨床意義
　　目的:通過構建組織芯片并運用免疫組織化學染色的方法明確CD105蛋白在JNA微血管中的表達,并分析其與JNA臨床病理特征以及復發(fā)之間的關系。
　

5、　方法:通過免疫組織化學染色方法在一套獨立的組織芯片(包括70例JNA患者的腫瘤組織)中檢測了CD105的表達情況,進行微血管計數,并分析其與年齡、JNA手術史、手術方式、腫瘤分期、術中出血等臨床病理特征的關系,同時進一步分析微血管密度(microvessel density,MVD)與JAN患者臨床病理參數及至復發(fā)時間(time to recurrence,TTR)的相關性。
　　結果:免疫組織化學檢測結果顯示,CD105僅表達

6、于血管內皮細胞中,在間質中未見明顯表達?？ǚ綑z驗分析發(fā)現微血管數目高低與腫瘤復發(fā)顯著相關(P=0.013)。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗顯示,低微血管密度患者的TTR顯著高于高微血管密度患者(P=0.009)。多因素回歸模型結果也提示,微血管密度是一個決定7NA預后的獨立因素(P=0.01)。
　　結論:CD105染色的腫瘤微血管密度可以預測JNA患者術后復發(fā),提示血管生成在JNA發(fā)生發(fā)展進程中可能起重要

7、作用,有望成為JNA治療靶點和預后預測指標。同時,為將CD105做為分離JNA血管內皮細胞的表面標記提供了臨床依據。
　　第二部分，人鼻咽纖維血管瘤血管內皮細胞分選、鑒定與培養(yǎng)
　　目的:分選、鑒定及傳代培養(yǎng)人鼻咽纖維血管瘤血管內皮細胞。
　　方法:采用抗CD105抗體交聯免疫磁珠,通過免疫磁珠分選法,對JNA組織進行血管內皮細胞分選;采用流式細胞術檢測陽性分選細胞的純度。通過細胞免疫化學法檢測vonWillebran

8、dfactor(vWF,又稱Ⅷ因子)的表達,并通過乙?；兔芏戎鞍讛z取實驗及小管生成實驗驗證陽性分選細胞是否具有血管內皮細胞的功能。
　　結果:流式檢測陽性分選細胞的CD105表達高達99％以上;細胞免疫化學檢測顯示陽性分選細胞中Ⅷ因子表達為陽性,超過95％的陽性分選細胞乙酰化低密度脂蛋白攝取實驗陽性;分選細胞在基質膠中可形成毛細管結構。同時可將陽性分選細胞進行傳代培養(yǎng)至10代以上,其內皮細胞特性仍存在。
　　結論:通過免

9、疫磁珠分選(MACs)法,我們成功分選獲得高純度的CD105陽性鼻咽纖維血管瘤血管內皮細胞(CD105+juvenile nasopharyngeal angiofibroma-derived endothelial cell,CD105+JEC),并能夠成功傳代培養(yǎng),為后續(xù)研究提供了細胞平臺。
　　第三部分，鼻咽纖維血管瘤血管內皮細胞與正常血管內皮細胞的功能比較
　　目的:比較JNA組織中分離的CD105陽性內皮細胞與人臍

10、靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的功能差異。
　　方法:采用CyQUANT法增殖實驗、劃痕實驗及Transwell侵襲實驗對比觀察兩種細胞體外的增殖、侵襲和遷移能力的異同;通過免疫熒光觀察細胞骨架蛋白肌動蛋白纖維(F-actin)的表達和細胞內定位分布的差異,運用Westernblot檢測基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,

11、MMP-2)及血管內皮細胞生長因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)相關信號通路蛋白表達水平異同。
　　結果:增殖實驗發(fā)現CD105+JEC的增殖能力低于HUVEC;而劃痕實驗、侵襲實驗及F-actin熒光染色顯示CD105+JEC的遷移和侵襲能力高于HUVEC;Westernblot結果顯示VEGFR1、p-MAPK、MMP-2在CD105+JNA血管內皮細