微環(huán)境影響血管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管的研究.pdf

1、組織工程產(chǎn)品的體積達(dá)到數(shù)立方毫米以上時(shí),其內(nèi)部的細(xì)胞將難以通過(guò)滲透作用獲得營(yíng)養(yǎng)和氧分的支持，而必須要求毛細(xì)血管的長(zhǎng)入才能維持其正常的代謝，否則移植后由于宿主血管未及時(shí)長(zhǎng)入而致?tīng)I(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)的不足，使生物支架內(nèi)細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致移植失敗。為了克服這個(gè)問(wèn)題，體積較大的組織工程產(chǎn)品在移植于宿主之前必須具有為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氣體交換的血管結(jié)構(gòu)。一個(gè)行之有效的的方法是將血管內(nèi)皮細(xì)胞與組織種子細(xì)胞共同接種于支架材料上，使構(gòu)建的組織工程產(chǎn)品在移植前自身

2、攜帶血管結(jié)構(gòu)。盡管這種方法顯示出良好的應(yīng)用前景，但是血管內(nèi)皮細(xì)胞在支架材料上存活率低、易凋亡，很難形成功能性血管結(jié)構(gòu)來(lái)維持移植物中細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給和氧氣交換。因此，本研究擬通過(guò)使用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架材料和極低頻電磁場(chǎng)處理改善血管內(nèi)皮細(xì)胞生存的微環(huán)境，提高其存活能力和形成功能性的血管結(jié)構(gòu)來(lái)解決組織工程產(chǎn)品移植宿主體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)供給問(wèn)題，以期為體積較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織工程產(chǎn)品最終臨床應(yīng)用探尋一條新的研究途徑。
　　實(shí)驗(yàn)分為三部分：
　　

3、1．異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其顆粒微載體的制備與相關(guān)性能研究
　　為了驗(yàn)證經(jīng)胰蛋白酶、NaOH和反復(fù)凍融法制備豬的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架作為體內(nèi)植入物的安全性，檢測(cè)支架材料中α-半乳糖、DNA殘余量、內(nèi)源性生長(zhǎng)因子、以及細(xì)胞和組織相容性；并將這種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)制成顆粒狀微載體，檢驗(yàn)其對(duì)組織工程皮膚種子細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力以及擴(kuò)增過(guò)程中形成的細(xì)胞-微載體復(fù)合物對(duì)裸鼠皮下組織填充和皮膚缺損愈合效果。結(jié)論：①利用胰蛋白酶、NaOH和反復(fù)凍融法制備

4、的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)不表達(dá)α-半乳糖抗原、DNA殘余量較少、具有良好的生物相容性并且含有內(nèi)源性的細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF和TGF-β，具有作為組織工程支架材料的可能性。②脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微載體可以有效地?cái)U(kuò)增成纖維細(xì)胞，而且在擴(kuò)增過(guò)程中可以形成組織工程微粒皮膚，這種微粒皮膚可以充當(dāng)軟組織的填充物以及難愈性皮膚創(chuàng)面的移植物。
　　2．脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微環(huán)境對(duì)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)的影響
　　為了驗(yàn)證脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微環(huán)境是否適合血

5、管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管結(jié)構(gòu)的形成，本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法，獲取原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料直接復(fù)合培養(yǎng)。結(jié)果顯示：脫細(xì)胞真皮基質(zhì)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，支持血管內(nèi)皮細(xì)胞在其微環(huán)境中形成管腔樣結(jié)構(gòu)。這提示脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞可以作為血管化的支架構(gòu)建體積較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織工程產(chǎn)品如肝臟、腎臟和心肌組織。
　　3．極低頻電磁微環(huán)境對(duì)新生血管形成作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　考慮到機(jī)體內(nèi)廣泛存在內(nèi)源性電磁場(chǎng)，本研究

6、提出了一種全新的“應(yīng)用外源性電磁處理”構(gòu)建組織工程產(chǎn)品血管化的策略，從單細(xì)胞、細(xì)胞共培養(yǎng)以及三維組織三個(gè)層次驗(yàn)證電磁微環(huán)境能夠促進(jìn)新生血管的形成。首先，檢測(cè)極低頻電磁場(chǎng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、在Matrigel基質(zhì)中形成管腔結(jié)構(gòu)的能力和細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響，以證明經(jīng)極低頻電磁場(chǎng)處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞容易形成血管結(jié)構(gòu)；其次，檢測(cè)極低頻電磁場(chǎng)對(duì)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系的血管形成的影響，以及將極低頻電磁場(chǎng)處理的臍靜脈血管內(nèi)

7、皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系移植于裸鼠皮下，術(shù)后1周檢測(cè)移植物中新生血管形成情況；然后，以膠原和第一部分制作的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)為材料復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞構(gòu)建組織工程真皮，經(jīng)極低頻電磁場(chǎng)處理后，檢測(cè)組織工程真皮中血管形成情況；最后，將含血管結(jié)構(gòu)的組織工程真皮移植于裸鼠皮膚缺損模型上，檢測(cè)新生皮膚中血管結(jié)構(gòu)形成情況。結(jié)論：①極低頻電磁場(chǎng)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)在Matrigel基質(zhì)中形成穩(wěn)定的管腔樣結(jié)構(gòu)以及促進(jìn)細(xì)

8、胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分中ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ、VCAM和bFGF的mRNA表達(dá)。②極低頻電磁場(chǎng)不僅促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系形成血管結(jié)構(gòu)，而且有利于共培養(yǎng)體系形成功能性血管結(jié)構(gòu)與宿主血管相吻合。③極低頻電磁場(chǎng)促進(jìn)以膠原和脫細(xì)胞真皮基質(zhì)為材料的組織工程真皮中血管結(jié)構(gòu)的形成。④經(jīng)極低頻電磁場(chǎng)處理的組織工程真皮形成的血管結(jié)構(gòu)更容易與宿主血管相吻合。
　　綜上所述，本研究成功制備一種免疫原性低、具有良好生物相容性以及含有內(nèi)