血管內皮細胞特異性分子-2(ECSM2)對血管新生作用的研究.pdf

1、目的：探討內皮細胞特異性分子2（ECSM2）的功能學表位，ECSM2與其他內皮細胞特異性分子之間的關系，ECSM2對內皮細胞功能的影響，以及ECSM2分子在血管新生性疾病組織中的表達。
　　方法：
　　1.利用CBS Prediction Servers生物信息學軟件預測ECSM2分子功能學表位；通過定點PCR突變技術將胞外段第54位酪氨酸突變?yōu)楸彼幔╕54A），構建表達Y54A突變的ECSM2真核表達載體p ECSM2

2、Y54A GFP和pECSM2 Y54A3FLAG。
　　2.將真核表達ECSM2 wild type和Y54A突變的質粒分別轉染293T細胞，通過免疫熒光和免疫共沉淀明確 ECSM2分子的膜定位和酪氨酸磷酸化位點；通過劃痕實驗和跨孔實驗檢測ECSM2分子對細胞遷移的影響。
　　3.用血管內皮細胞生長因子（VEGF）刺激人臍靜脈內皮細胞HUVEC，利用免疫印跡和免疫共沉淀檢測ECSM2分子與VE-Cadherin分子之間的關

3、系。
　　4.將HUVEC細胞接種Matrigel，用Real Time PCR檢測體外血管新生過程中ecsm2基因表達水平的變化；用siRNA干擾技術抑制ecsm2基因表達，用Tube formation assay和in vitro permeability assay觀察對體外血管形成及血管穩(wěn)定性的影響。
　　5.收集46例肝臟惡性腫瘤標本（包括腫瘤組織和癌旁組織），做免疫組化分析，結合病人資料采用SAS9.2統(tǒng)計軟件

4、進行數(shù)據(jù)分析。
　　結果：
　　1. ECSM2分子胞外段潛在功能位點為1個酪氨酸磷酸化位點（Y54，tyrosine）、12個絲/蘇氨酸磷酸化位點、1個 N-糖基化（N96，Asparagine）和23個O-糖基化位點。胞內段有7個可能的絲氨酸磷酸化位點。
　　2. ECSM2分子胞外段第54位酪氨酸殘基突變（Y54A）不影響ECSM2分子的膜定位；該位點被證實為酪氨酸磷酸化位點。Y54A突變解除了ECSM2分子對細

5、胞遷移的抑制。
　　3. VEGF刺激HUVEC，促進ECSM2與VE-cadherin分子間結合。
　　4. ECSM2分子在體外血管形成中轉錄水平降低，與血管穩(wěn)定性維持相關。
　　5. ECSM2在肝臟惡性腫瘤組織中表達水平升高。
　　結論：ECSM2分子第54位酪氨酸殘基是酪氨酸磷酸化位點，該位點突變不影響ECSM2分子膜定位，但阻遏了ECSM2對生長因子誘導性細胞遷移的抑制，提示該位點參與ECSM2分子對