MicroRNAs對血管內皮細胞衰老及血管功能影響的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　衰老是心血管疾病的獨立危險因素，包括冠心病、高血壓、中風。伴隨著年齡的增加，機體內會發(fā)生很多年齡相關的功能和結構改變，其中內皮功能紊亂是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的起始階段。但是血管細胞，尤其是內皮細胞，是如何出現衰老表型，衰老是如何影響血管功能并導致衰老相關的血管疾病，這一過程仍需要大量的研究。
　　微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是一類小的非編碼RNA，在調節(jié)內皮細胞衰老方面發(fā)揮重要調控作用

2、。已知的芯片結果發(fā)現miR-216a/miR-181b在衰老的內皮細胞中表達上調，但其作用機制仍不清楚。
　　研究方法:
　　1.原代培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），建立HUVECs衰老模型。實時熒光定量PCR在PDL8及PDL44內皮細胞中檢測miR-216a/miR-181b，比較其表達水平。
　　2.通過病毒感染建立穩(wěn)定高表達mi

3、R-216a的內皮細胞系，檢測衰老相關的β半乳糖苷酶(Senescence Associatedβ-Galactosidase，SA-β-gal)活性、細胞周期蛋白表達水平、端粒長度及端粒酶活性，鑒定其是否出現衰老表型。
　　3.分別用MTS法、Scraching實驗、成管實驗及粘附實驗檢測過表達miR-216a/miR-181b的內皮細胞增殖、遷移、成管和粘附功能的改變。
　　4.通過生物信息學方法預測與miR-216a/

4、miR-181b存在結合位點的靶基因，在內皮細胞中過表達miR-216a/miR-181b，用western blot檢測靶基因的表達變化。熒光素酶報告系統實驗檢測miR-216a/miR-181b與靶基因是否直接結合。
　　研究結果:
　　（一）MiR-216a對血管內皮細胞衰老和內皮細胞功能的影響
　　1.與PDL8 HUVECs相比，PDL44 HVUECs的SA-β-gal藍染細胞比例增加4.7倍(P＜0.00

5、1)，p53及p21表達分別上調69％(P=0.003)和61％(P=0.01)，端粒長度縮短42％(P=0.01)，呈現明顯衰老狀態(tài)。在PDL44 HUVECs中，miR-216a表達上調59％(P=0.028)。
　　2.與對照組相比，過表達miR-216a的內皮細胞傳代到PDL20時出現明顯的形態(tài)學變化及生長抑制。在PDL20 HUVECs的SA-β-gal藍染細胞比率增加61％(P=0.001)，p53和p21的表達水平顯

6、著上調，端粒酶活性下降13％(P=0.031);但端粒長度未發(fā)現明顯改變。
　　3.MiR-216a可使PDL20 HUVECs增殖功能下降15％(P＜0.001)，遷移能力下降16％(P＜0.001)，內皮細胞對單核細胞的粘附能力上調95％（P=0.002）;反之，給予PDL44 HUVECs miR-216a的抑制劑，內皮細胞增殖能力上調12％(P=0.027)，遷移能力增加11％=(P=0.012），粘附能力下降16％(P=

7、0.01)。
　　4.生物信息學預測發(fā)現SMAD7可能是miR-216a的靶基因，在內皮細胞中過表達miR-216a可抑制SMAD7表達50％（P=0.02），且熒光素酶報告系統實驗檢測到miR-216a可與SMAD73'-UTR區(qū)的直接結合，使熒光素酶活性下降91％(P＜0.001)。
　　（二）MiR-181b對血管內皮細胞衰老和內皮細胞功能的影響
　　1.在PDL44 HUVECs中，miR-181b表達上調64

8、％(P=0.046)。
　　2.與對照組相比，過表達miR-181b可抑制PDL8內皮細胞的增殖能力22％(P＜0.001)、遷移能力23％（P＜0.001），對成管能力沒有顯著影響。
　　3.在PDL44 HUVECs中，IGF1R的mRNA和蛋白水平分別下調39％和45％（P=0.004，P=0.014）。熒光素酶活性實驗顯示miR-181b可與IGF1R的3'UTR結合，但過表達miR-181b對IGF1R的蛋白表達水

9、平無顯著影響(P＞0.05)。在缺氧應激條件下，miR-181b可上調IGF1R的表達27％(P=0.005)。
　　結論:
　　本研究結果表明miR-216a可誘導內皮細胞出現早衰表型，并起到促進內皮細胞粘附能力，抑制內皮細胞增殖、遷移能力的作用，其可能的分子機制是通過抑制SMAD7的表達來發(fā)揮其調節(jié)功能。MiR-181b抑制血管內皮細胞增殖、遷移等血管新生能力，這一作用與miR-181b在缺氧應激條件下上調血管發(fā)育相關基