MicroRNAs對血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老及血管功能影響的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　衰老是心血管疾病的獨立危險因素，包括冠心病、高血壓、中風(fēng)。伴隨著年齡的增加，機體內(nèi)會發(fā)生很多年齡相關(guān)的功能和結(jié)構(gòu)改變，其中內(nèi)皮功能紊亂是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的起始階段。但是血管細(xì)胞，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞，是如何出現(xiàn)衰老表型，衰老是如何影響血管功能并導(dǎo)致衰老相關(guān)的血管疾病，這一過程仍需要大量的研究。
　　微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是一類小的非編碼RNA，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞衰老方面發(fā)揮重要調(diào)控作用

2、。已知的芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-216a/miR-181b在衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，但其作用機制仍不清楚。
　　研究方法:
　　1.原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），建立HUVECs衰老模型。實時熒光定量PCR在PDL8及PDL44內(nèi)皮細(xì)胞中檢測miR-216a/miR-181b，比較其表達(dá)水平。
　　2.通過病毒感染建立穩(wěn)定高表達(dá)mi

3、R-216a的內(nèi)皮細(xì)胞系，檢測衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶(Senescence Associatedβ-Galactosidase，SA-β-gal)活性、細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平、端粒長度及端粒酶活性，鑒定其是否出現(xiàn)衰老表型。
　　3.分別用MTS法、Scraching實驗、成管實驗及粘附實驗檢測過表達(dá)miR-216a/miR-181b的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管和粘附功能的改變。
　　4.通過生物信息學(xué)方法預(yù)測與miR-216a/

4、miR-181b存在結(jié)合位點的靶基因，在內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)miR-216a/miR-181b，用western blot檢測靶基因的表達(dá)變化。熒光素酶報告系統(tǒng)實驗檢測miR-216a/miR-181b與靶基因是否直接結(jié)合。
　　研究結(jié)果:
　　（一）MiR-216a對血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老和內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　1.與PDL8 HUVECs相比，PDL44 HVUECs的SA-β-gal藍(lán)染細(xì)胞比例增加4.7倍(P＜0.00

5、1)，p53及p21表達(dá)分別上調(diào)69％(P=0.003)和61％(P=0.01)，端粒長度縮短42％(P=0.01)，呈現(xiàn)明顯衰老狀態(tài)。在PDL44 HUVECs中，miR-216a表達(dá)上調(diào)59％(P=0.028)。
　　2.與對照組相比，過表達(dá)miR-216a的內(nèi)皮細(xì)胞傳代到PDL20時出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化及生長抑制。在PDL20 HUVECs的SA-β-gal藍(lán)染細(xì)胞比率增加61％(P=0.001)，p53和p21的表達(dá)水平顯

6、著上調(diào)，端粒酶活性下降13％(P=0.031);但端粒長度未發(fā)現(xiàn)明顯改變。
　　3.MiR-216a可使PDL20 HUVECs增殖功能下降15％(P＜0.001)，遷移能力下降16％(P＜0.001)，內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞的粘附能力上調(diào)95％（P=0.002）;反之，給予PDL44 HUVECs miR-216a的抑制劑，內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力上調(diào)12％(P=0.027)，遷移能力增加11％=(P=0.012），粘附能力下降16％(P=

7、0.01)。
　　4.生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)SMAD7可能是miR-216a的靶基因，在內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)miR-216a可抑制SMAD7表達(dá)50％（P=0.02），且熒光素酶報告系統(tǒng)實驗檢測到miR-216a可與SMAD73'-UTR區(qū)的直接結(jié)合，使熒光素酶活性下降91％(P＜0.001)。
　?。ǘ㎝iR-181b對血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老和內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　1.在PDL44 HUVECs中，miR-181b表達(dá)上調(diào)64

8、％(P=0.046)。
　　2.與對照組相比，過表達(dá)miR-181b可抑制PDL8內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力22％(P＜0.001)、遷移能力23％（P＜0.001），對成管能力沒有顯著影響。
　　3.在PDL44 HUVECs中，IGF1R的mRNA和蛋白水平分別下調(diào)39％和45％（P=0.004，P=0.014）。熒光素酶活性實驗顯示miR-181b可與IGF1R的3'UTR結(jié)合，但過表達(dá)miR-181b對IGF1R的蛋白表達(dá)水

9、平無顯著影響(P＞0.05)。在缺氧應(yīng)激條件下，miR-181b可上調(diào)IGF1R的表達(dá)27％(P=0.005)。
　　結(jié)論:
　　本研究結(jié)果表明miR-216a可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)早衰表型，并起到促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞粘附能力，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移能力的作用，其可能的分子機制是通過抑制SMAD7的表達(dá)來發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。MiR-181b抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移等血管新生能力，這一作用與miR-181b在缺氧應(yīng)激條件下上調(diào)血管發(fā)育相關(guān)基