氟對體外培養(yǎng)血管內皮細胞功能的影響.pdf

1、目的： 本實驗通過綜合運用體外細胞培養(yǎng)技術、細胞免疫組化技術、流式細胞儀技術及相關生化指標檢測等多種方法初次研究不同濃度的氟對體外培養(yǎng)的臍靜脈血管內皮細胞生長與功能的影響，觀察不同氟濃度與血管內皮細胞活性與功能的關系，為探討微量元素氟對人體的影響與作用提供有效的實驗支持，豐富對氟的實驗研究。 材料與方法： 1、培養(yǎng)：以含有10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人臍靜脈血管內皮細胞株。304(HLJECV-304)

2、，傳代待細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后進行各項實驗。 2、制備單細胞懸液密度為0.8～1.0×10<'5>個/ml，種24孔板，待細胞貼壁后加入不同濃度的氟化鈉溶液，每板均設對照組，于4、8、12、24、48小時觀察細胞生長狀況及細胞形態(tài)學變化，進行細胞計數(shù)，留取培養(yǎng)液待測。 3、MTT實驗檢測細胞增殖情況：在氟處理后的96孔細胞培養(yǎng)板中每孔添加MTT試劑20μl(5m/ml)，37℃孵育4h、8h、12h、24h及48h后終止培養(yǎng)

3、，小心棄去培養(yǎng)液，用胰酶消化細胞，每孔加入15μl二甲基亞砜(DMSO)溶解，振蕩10min。用酶標分析儀在490nm波長下測其光吸收值(A)，可間接反映細．胞增殖情況。 4、免疫組織化學：將消毒好的蓋玻片放入24孔培養(yǎng)板，接種細胞，待細胞貼壁后加入各實驗因素，培養(yǎng)24h后終止。除去培養(yǎng)液，PBS沖洗，滴加一抗二抗，顯色前用鑷子小心將蓋玻片取出進行．DAB顯色，觀察PCNA，Ki-67的表達。 5、流式細胞術：待測細胞經

4、離心-PBS沖洗-吹勻-固定-再離心-沖洗一吹打一染色(4℃，20～30分鐘)后，400目尼龍網過濾后上機檢測。Cell quest分析軟件分析，用細胞分裂增殖指數(shù)(PI)表示相對增殖活力。PI=(S+G<,2>/M)/(G<,0>/G<,1>+S+G<,2>/M)。 6、代謝功能檢測：利用試劑盒對培養(yǎng)細胞的上清液中細胞脂質過氧化酶丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和超氧化物岐化酶(SOD)進行檢測。 結果： 1、培養(yǎng)

5、4h～48h時，120～240umol/L劑量組對血管內皮細胞增殖活力有明顯刺激作用，表現(xiàn)為細胞數(shù)目增多，隨著氟作用時間的延長及氟濃度的增加，刺激細胞增殖的能力明顯減弱，在720～96μtmol/L劑量時細胞改變最為明顯，細胞數(shù)量減少，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，細胞呈長梭形、星形，似成纖維細胞，內皮細胞收縮，細胞間隙加寬，胞漿中出現(xiàn)暗色顆粒。 2、加氟培養(yǎng)后24h血管內皮細胞免疫組化顯示120～240μmol/L劑量組的血管內皮細

6、胞PCNA、Ki-67表達陽性率升高，表達率約為80﹪，而對照組及其480～60μmol/L劑量組表達相對較弱，約為40～45﹪，而720～96μmol/L劑量組表達率較低僅為20﹪左右。 3、加氟培養(yǎng)后的血管內皮細胞功能受到了一定影響，MDA、SOD及NO含量發(fā)生了變化：隨著氟濃度的逐漸升高，MDA的含量逐漸升高，NO的含量逐漸下降。SOD的含量在低濃度和作用時間不長時稍有增高，隨后開始下降。 結論： 1、體外