體外高甘油三酯狀態(tài)下LPS對血管內(nèi)皮細胞分泌功能的影響.pdf

1、目的：利用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)原代培養(yǎng)的優(yōu)化方法，成功構建臍靜脈血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)模型。在此基礎上，以不同濃度的細菌內(nèi)毒素(Lipopolyssacarides,LPS)和甘油三酯(Triglycerides，TG)共同干預受試細胞的生長，觀察作用前后不同時間段靶細胞分泌腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)和內(nèi)皮素(En

2、dothelin，ET)的變化，并確立其轉錄調控分子水平的依據(jù)，從始動環(huán)節(jié)部分闡明心腦血管性疾病的致病機制，為研發(fā)拮抗內(nèi)毒素藥物和預防心腦血管疾病提供理論基礎與實驗依據(jù)。 方法：1．分別比較不同濃度的胰蛋白酶和膠原酶灌注臍靜脈、灌注消化法和機械刮除法、不同pH值的培養(yǎng)液對細胞形態(tài)、數(shù)量等生長影響來優(yōu)化細胞模型的構建，并從鏡下形態(tài)觀察和應用Ⅷ因子相關抗原免疫組化方法對獲得細胞作出鑒定。2．原代細胞經(jīng)穩(wěn)定傳代后取對數(shù)生長期的細胞作為

3、受試細胞，用不同濃度的LPS和TG對受試細胞作用，在不同時間段收集細胞培養(yǎng)的上清液，分別應用<'125>I放射性核素標記TNF和ET的抗體，對所收集的標本進行放射免疫(RIA)定量分析，給出各組HUVEC培養(yǎng)液中TNF和ET含量。3．按照引物合成原則并利用相關合成軟件分別設計TNF，ET引物，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增FNF和ET的mRNA，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外透射儀上肉眼觀察結果并攝影記錄，同時采用凝

4、膠分析軟件測算各條帶光密度值，進行分析比較。 結果：1.臍靜脈內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)時，采用0.1％膠原酶灌注消化12min，連續(xù)培養(yǎng)使用pH值7.4含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液明顯優(yōu)于其它細胞培養(yǎng)條件。2.倒置顯微鏡下觀察細胞為單層生長，呈鵝卵石樣鑲嵌排列。免疫組織化學染色細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，符合內(nèi)皮細胞的Ⅷ因子抗原免疫組化特征表現(xiàn)。3.LPS和TG均能明顯促進HUVEC分泌TNF、ET，其中l(wèi)gg/mlLPS，10mmo

5、l/LTG作用24h達最大效應，各組與對照組相比存在顯著性差異(p≤0.05)。4.lμg/ml的LPS分別和lmmol/L、5mmol/L、10mmol/L濃度的TG共同作用HUVEC，分泌INF和ET量大于單一因素刺激HUVEC分泌量，其中1μg/ml的L,PS和10mmol/LTG刺激24h作用最強，ET的分泌量達到784.6±7.3pg/ml，較10mmol/L,TG單獨作用24h組、1μg/ml LPS單獨作用24h組分泌量均

6、增加2倍；TNF分泌量達到19.06±0.29ng/ml，較10mmol/L,TG單獨作用24h組、1μg/mlLPS單獨作用24h組分泌量分別增加4倍和3倍，與對照組相比存在顯著性差異(p≤0.01)。5.RT-PCR顯示1μg／mlLPS與不同濃度的TG共同刺激24h后，各組受試細胞mRNA在352bp和318bp處擴增條帶亮度明顯增強。軟件分析結果經(jīng)統(tǒng)計學處理，實驗各組與對照組相比較，均有顯著性差異(p＜0.05)。 結論

7、：1．經(jīng)過優(yōu)化的原代培養(yǎng)，成功構建血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)模型。2.LPS和TG均能單獨誘導HUVEC分泌TNF和ET，與文獻報道一致。3.LPS和TG共同作用HUVEC時，受試細胞分泌TNF和ET量較單一因素作用明顯增高，提示LPS在TG引起心血管疾病中具有協(xié)同作用。4.RT-PCR結果進一步提示LPS這種協(xié)同作用是通過轉錄水平的mRNA表達上調來實現(xiàn)的。5減少LPS的吸收，降低血中LPS的常態(tài)含量，避免LPS的異常波動，同時控制體內(nèi)TG