體外高甘油三酯狀態(tài)下LPS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的影響.pdf

1、目的：利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)原代培養(yǎng)的優(yōu)化方法，成功構(gòu)建臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型。在此基礎(chǔ)上，以不同濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素(Lipopolyssacarides,LPS)和甘油三酯(Triglycerides，TG)共同干預(yù)受試細(xì)胞的生長(zhǎng)，觀察作用前后不同時(shí)間段靶細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)和內(nèi)皮素(En

2、dothelin，ET)的變化，并確立其轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子水平的依據(jù)，從始動(dòng)環(huán)節(jié)部分闡明心腦血管性疾病的致病機(jī)制，為研發(fā)拮抗內(nèi)毒素藥物和預(yù)防心腦血管疾病提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1．分別比較不同濃度的胰蛋白酶和膠原酶灌注臍靜脈、灌注消化法和機(jī)械刮除法、不同pH值的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量等生長(zhǎng)影響來優(yōu)化細(xì)胞模型的構(gòu)建，并從鏡下形態(tài)觀察和應(yīng)用Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化方法對(duì)獲得細(xì)胞作出鑒定。2．原代細(xì)胞經(jīng)穩(wěn)定傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為

3、受試細(xì)胞，用不同濃度的LPS和TG對(duì)受試細(xì)胞作用，在不同時(shí)間段收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，分別應(yīng)用<'125>I放射性核素標(biāo)記TNF和ET的抗體，對(duì)所收集的標(biāo)本進(jìn)行放射免疫(RIA)定量分析，給出各組HUVEC培養(yǎng)液中TNF和ET含量。3．按照引物合成原則并利用相關(guān)合成軟件分別設(shè)計(jì)TNF，ET引物，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增FNF和ET的mRNA，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外透射儀上肉眼觀察結(jié)果并攝影記錄，同時(shí)采用凝

4、膠分析軟件測(cè)算各條帶光密度值，進(jìn)行分析比較。 結(jié)果：1.臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)，采用0.1％膠原酶灌注消化12min，連續(xù)培養(yǎng)使用pH值7.4含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液明顯優(yōu)于其它細(xì)胞培養(yǎng)條件。2.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞為單層生長(zhǎng)，呈鵝卵石樣鑲嵌排列。免疫組織化學(xué)染色細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，符合內(nèi)皮細(xì)胞的Ⅷ因子抗原免疫組化特征表現(xiàn)。3.LPS和TG均能明顯促進(jìn)HUVEC分泌TNF、ET，其中l(wèi)gg/mlLPS，10mmo

5、l/LTG作用24h達(dá)最大效應(yīng)，各組與對(duì)照組相比存在顯著性差異(p≤0.05)。4.lμg/ml的LPS分別和lmmol/L、5mmol/L、10mmol/L濃度的TG共同作用HUVEC，分泌INF和ET量大于單一因素刺激HUVEC分泌量，其中1μg/ml的L,PS和10mmol/LTG刺激24h作用最強(qiáng)，ET的分泌量達(dá)到784.6±7.3pg/ml，較10mmol/L,TG單獨(dú)作用24h組、1μg/ml LPS單獨(dú)作用24h組分泌量均

6、增加2倍；TNF分泌量達(dá)到19.06±0.29ng/ml，較10mmol/L,TG單獨(dú)作用24h組、1μg/mlLPS單獨(dú)作用24h組分泌量分別增加4倍和3倍，與對(duì)照組相比存在顯著性差異(p≤0.01)。5.RT-PCR顯示1μg／mlLPS與不同濃度的TG共同刺激24h后，各組受試細(xì)胞mRNA在352bp和318bp處擴(kuò)增條帶亮度明顯增強(qiáng)。軟件分析結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)各組與對(duì)照組相比較，均有顯著性差異(p＜0.05)。 結(jié)論

7、：1．經(jīng)過優(yōu)化的原代培養(yǎng)，成功構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型。2.LPS和TG均能單獨(dú)誘導(dǎo)HUVEC分泌TNF和ET，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。3.LPS和TG共同作用HUVEC時(shí)，受試細(xì)胞分泌TNF和ET量較單一因素作用明顯增高，提示LPS在TG引起心血管疾病中具有協(xié)同作用。4.RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步提示LPS這種協(xié)同作用是通過轉(zhuǎn)錄水平的mRNA表達(dá)上調(diào)來實(shí)現(xiàn)的。5減少LPS的吸收，降低血中LPS的常態(tài)含量，避免LPS的異常波動(dòng)，同時(shí)控制體內(nèi)TG