黃芩莖葉總黃酮對(duì)高甘油三酯血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、隨著人們生活水平的提高，生活方式的改變，以及人口老齡化的迅速到來(lái)，心腦血管疾病已成為當(dāng)今世界上危害人類(lèi)生命和健康的最主要的疾病。動(dòng)脈粥樣硬化(arterio sclerosis，AS)是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明，高甘油三酯(hightriglyceride，HTG)血癥是導(dǎo)致AS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，它可通過(guò)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、引起脂質(zhì)過(guò)氧化、促進(jìn)血栓

2、形成等啟動(dòng)AS。在高甘油三酯血癥導(dǎo)致AS的過(guò)程中，由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)增多引起的氧化應(yīng)激所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能起到了極其重要的作用?；钚匝跏钦{(diào)節(jié)血管功能狀態(tài)的重要信號(hào)分子，在生理和病理情況下，體內(nèi)有多種酶參與了ROS的生成。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH oxidase)目

3、前被認(rèn)為是血管內(nèi)生成ROS的主要酶體，內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)NADPH氧化酶家族(NOX)中的NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4，NOX4)。那么，在HTG誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷過(guò)程中，是否通過(guò)NADPH氧化酶途徑?目前關(guān)于這一研究國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道，這正是本課題所要研究的內(nèi)容之一，期望從新的角度揭示高甘油三酯血癥致AS的機(jī)制并為其防治提供理論依據(jù)。
　　 黃芩莖葉總黃酮(scutellaria baicalensis st

4、em-leaf total flavonoid，SSTF)為黃芩莖葉的提取物，其主要成分為黃酮類(lèi)化合物。已進(jìn)行的藥理學(xué)研究表明，SSTF對(duì)心腦血管系統(tǒng)具有廣泛的作用，如抗氧化、降血壓、調(diào)血脂、改善心腦血管的供血等。那么，SSTF對(duì)HTG誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷是否有保護(hù)作用?其保護(hù)作用機(jī)制是否與抑制NADPH氧化酶表達(dá)有關(guān)?這是本課題所要研究的另一內(nèi)容，研究結(jié)果有助于為尋找新的抗AS藥物作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：

5、　　 1.研究人高甘油三酯(HTG)血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的氧化損傷效應(yīng)，特別是NADPH氧化酶亞型NOX4在HTG致HUVEC氧化損傷中的作用。
　　 2.觀察黃芩莖葉總黃酮(SSTF)對(duì)HTG誘導(dǎo)的HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用，并從分子水平探討其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.HTG對(duì)HUVEC的氧化損傷效應(yīng)：體外培養(yǎng)HUVEC，分別加入1％、2％、3％、4％、5％的HTG作用于細(xì)胞，在8

6、h、12h、16h、20h及24h，通過(guò)四唑氮(MTT)比色法測(cè)定各組細(xì)胞活力(OD值)，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBA)法測(cè)定丙二醛(MDA)含量，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，觀察HTG對(duì)HUVEC的氧化損傷效應(yīng)，并確定最佳的HTG作用濃度和時(shí)間。
　　 2.NOX4在HTG致HUVEC氧化損傷中的作用：體外培養(yǎng)HUVEC，加入5％HTG作用于細(xì)胞16h，通過(guò)

7、RT-PCR法檢測(cè)NOX4 mRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)NOX4蛋白表達(dá)，觀察HTG刺激后HUVEC中NOX4的表達(dá)情況。
　　 3.SSTF對(duì)HTG致HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用：終濃度為100mg/L、200mg/L、400mg/L的SSTF以及陽(yáng)性對(duì)照藥物100mg/L的VitC分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16h，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、SOD活性、MDA含量及ROS水平的變化，觀察SSTF的保護(hù)作用

8、，并與VitC相比較。
　　 4.SSTF對(duì)HTG致HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制：終濃度為100mg/L、200mg/L、400mg/L的SSTF分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16h，通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)NOX4 mRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)NOX4蛋白表達(dá)，觀察SSTF作用后HUVEC中NOX4的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.HTG對(duì)HUVEC的氧化損傷效應(yīng)：MTT結(jié)果顯示

9、，與Control組相比，4％的HTG作用24h、5％的HTG作用16h以上對(duì)HUVEC活力(OD值)有明顯抑制作用(P<0.01)，并呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴(lài)關(guān)系；SOD結(jié)果顯示，與Control組相比，2％的HTG作用24h、3％及4％的HTG作用20h以上、5％的HTG作用16h以上可引起HUVEC的SOD活性明顯降低(P<0.01)，并呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴(lài)關(guān)系；MDA結(jié)果顯示，與Control組相比，2％的HTG作用20h以上、3％的H

10、TG作用16h以上、4％及5％的HTG作用8h以上可引起HUVEC中MDA含量明顯增加(P<0.01)，并呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴(lài)關(guān)系；ROS結(jié)果顯示，未加HTG刺激時(shí)，HUVEC內(nèi)可以檢測(cè)到一定量的ROS，表明基礎(chǔ)狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)也有ROS產(chǎn)生，給予HTG刺激后細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增加，與Control組相比，1％HTG作用16h以上、2％HTG及以上濃度作用8h以上均可引起細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增加(P<0.01)，并呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴(lài)關(guān)系，尤以5％H

11、TG作用16h增加最為明顯。結(jié)合以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定本實(shí)驗(yàn)HTG最佳氧化損傷濃度為5％，最佳作用時(shí)間為16h。
　　 2.NOX4在HTG致HUVEC氧化損傷中的作用：RT-PCR結(jié)果顯示，未加HTG刺激的HUVEC內(nèi)有NOX4 mRNA表達(dá)，給予HTG刺激后，細(xì)胞內(nèi)NOX4mRNA表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示，未加HTG刺激的HUVEC內(nèi)有NOX4蛋白表達(dá)，給予HTG

12、刺激后細(xì)胞內(nèi)NOX4蛋白表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.SSTF對(duì)HTG致HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用：MTT結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF和100mg/L的VitC都能增加受損細(xì)胞活力(OD值)，尤以400mg/L的SSTF和100mg/L的VitC為明顯(P<0.01)；SOD結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF和100mg/L的VitC都能明顯升高氧化損傷細(xì)胞的S

13、OD活性(P<0.05或P<0.01)；MDA結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF和100mg/L的VitC都能顯著降低HUVEC的MDA含量(P<0.01)；ROS結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF和100mg/L的VitC都能顯著減少HUVEC內(nèi)ROS的生成(P<0.01)。
　　 4.SSTF對(duì)HTG致HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制：RT-PCR結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF都能下調(diào)HTG

14、氧化損傷的HUVEC中NOX4 mRNA表達(dá)，除100mg/L的SSTF外，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示，與HTG組相比，各濃度組的SSTF均能顯著下調(diào)HTG氧化損傷的HUVEC的NOX4蛋白表達(dá)(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.高甘油三酯血清能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，其氧化損傷的程度與高甘油三酯血清的濃度呈現(xiàn)依賴(lài)關(guān)系。
　　 2.高甘油三酯血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞

15、氧化損傷可能通過(guò)NADPH氧化酶途徑，NOX4作為內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶的主要表達(dá)形式，在此氧化損傷過(guò)程中可能起一定作用。
　　 3.SSTF對(duì)高甘油三酯血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，能提高內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化效應(yīng)、減少細(xì)胞內(nèi)活性氧生成。
　　 4.SSTF可下調(diào)高甘油三酯血清氧化損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的氧化酶NOX4的mRNA和蛋白表達(dá)，提示SSTF可能通過(guò)抑制NADPH氧化酶表達(dá)進(jìn)而減少R