保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的食藥用真菌粗提物篩選及對(duì)高糖損傷內(nèi)皮的保護(hù)作用.pdf

1、本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述。
　　第一部分高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷模型的建立及食藥用真菌粗提物的篩選
　　目的：
　　觀察古尼蟲(chóng)草、花臉香菇、冬蟲(chóng)夏草、巴西革耳4種食藥用真菌粗提物對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）增殖活性的影響，篩選具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞活性的有效菌菇。
　　方法：
　　體外原代培養(yǎng)HUVECs，以細(xì)胞形態(tài)及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。HUVECs分為對(duì)照組(M199正常培養(yǎng)液)、

2、高糖組（40mmol/L高糖培養(yǎng)液）、4種食藥用真菌（古尼蟲(chóng)草、花臉香菇、冬蟲(chóng)夏草和巴西革耳）粗提物干預(yù)組（每種粗提物以終濃度12.5、25、50、100ug/ml+高糖培養(yǎng)液），以四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。
　　結(jié)果：
　　1. HUVECs于80％融合時(shí)呈單層鋪路石樣外觀，95%以上細(xì)胞Ⅷ因子檢測(cè)呈陽(yáng)性。
　　2.高糖（40mmol/L）作用48h后HUVECs的MTT OD值顯著低于正常對(duì)照

3、組（P<0.05）。與高糖組相比，古尼蟲(chóng)草粗提物（12.5-100 ug/ml）干預(yù)后HUVECs的OD值無(wú)明顯改變（P>0.05）；花臉香菇及巴西革耳隨著干預(yù)濃度增加（12.5-100ug/ml），各組OD值均顯著降低(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性遞減趨勢(shì)；而冬蟲(chóng)夏草粗提物（12.5-50ug/ml）干預(yù)后， HUVECs的OD值顯著增加（P<0.05），并呈劑量依賴(lài)性；但在100 ug/ml冬蟲(chóng)夏草作用下，OD值反而稍下降，但較高

4、糖組仍有所上升，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)成功建立了高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外損傷模型。冬蟲(chóng)夏草粗提物在一定劑量范圍（12.5 umo l/L-50 umo l/L）內(nèi)呈劑量依賴(lài)性地抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。而古尼蟲(chóng)草、花臉香菇、巴西革耳等粗提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷無(wú)效。
　　第二部分冬蟲(chóng)夏草粗提物保護(hù)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制研究
　　目的：
　　糖尿病及其血管并發(fā)癥

5、嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，已證實(shí)高血糖可通過(guò)多種直接或間接途徑損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化等血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探討冬蟲(chóng)夏草粗提物（CSE）對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）損傷的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　體外原代培養(yǎng) HUVECs，用高糖(40mmol/L)誘導(dǎo)建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷的體外模型。HUVECs分為對(duì)照組(M199正常培養(yǎng)液)、高糖組（40mmol/L高糖培養(yǎng)液）、冬蟲(chóng)夏草粗提物干預(yù)組（以終濃度12

6、.5、25、50、100ug/ml）。以四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布和細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量；分光光度法檢測(cè)細(xì)胞上清液中一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量；實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR測(cè)定實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)Nox4、eNOS、內(nèi)皮素-1、E選擇素及Sirt1的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)高糖干預(yù)48h后HUVECs的MTT法

7、吸光度值OD值顯著下降,G0/G1期的細(xì)胞百分率明顯增加，S+G2/M期的細(xì)胞百分率明顯下降,且 ROS水平亦增加（P均<0.05）。細(xì)胞上清液中NO、SOD含量減少，MDA含量增高（P均<0.05）。同時(shí)，細(xì)胞Nox4、內(nèi)皮素-1、E選擇素mRNA表達(dá)水平上調(diào)及eNOS、Sirt1 mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05）。
　　2.與高糖組相比，CSE（12.5-50μg/mL）孵育48h后細(xì)胞OD值顯著提高（P<0.05）；G0

8、/G1期的細(xì)胞百分率明顯下降，S+G2/M期的細(xì)胞百分率明顯上升,且ROS水平降低（P均<0.05）；細(xì)胞上清液中NO、SOD含量升高，MDA含量降低（P均<0.05）。同時(shí)與高糖組相比，細(xì)胞Nox4、內(nèi)皮素-1、E選擇素的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，eNOS、Sirt1的 mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P<0.01）
　　結(jié)論：
　　冬蟲(chóng)夏草粗提物可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)程抑制凋亡；可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌，下調(diào)E-