黃芩苷對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、目的：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是危害人類健康的主要疾病之一，對(duì)．AS發(fā)病機(jī)制的研究一直是熱點(diǎn)。雖然人們先后提出脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、中膜平滑肌增殖學(xué)說(shuō)、血栓源學(xué)說(shuō)等，但都不能對(duì)AS的發(fā)病機(jī)制提供滿意的解釋。1999年Ross等提出“AS是一種炎癥性疾病”的概念，指出AS是具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過(guò)程，其發(fā)展過(guò)程始終伴隨炎癥反應(yīng)。近年來(lái)許多研究認(rèn)為AS與感染肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae，Cpn)

2、有關(guān)，本課題組曾報(bào)道肺炎衣原體感染血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelial cell，VEC)后，細(xì)胞上清中TNF-α含量增加，黃芩苷高、中、低劑量均可使之下調(diào)。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)觀察了黃芩苷對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，以進(jìn)一步探討黃芩苷的抗損傷機(jī)制。 方法： 1．人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞的培養(yǎng)將HUVEC在25cm<'2>的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以含體積分?jǐn)?shù)為15％的小牛血清，100U

3、/ml青、鏈霉素雙抗液的RPIM-1640培養(yǎng)液，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)至80％融合時(shí)，用含胰蛋白酶-EDTA消化，傳代。 2．TNF-α及黃芩苷聯(lián)合對(duì)HUVEC增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC以2.5x10<'5>/ml濃度接種于96孔板，每孔100μl，待長(zhǎng)成單層后，加入HNF-α50ng/ml為模型組，加入黃芩苷120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml預(yù)處理24h后，再加入TNF-

4、α為黃芩苷高、中、低劑量組，并設(shè)立不加任何刺激物者為正常組，正常細(xì)胞加黃芩苷組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。放置37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；結(jié)束前4h每孔加入四甲基偶氮唑鹽(MTT)20μl，4h后每孔再加150μl二甲基亞砜(DMSO)，待沉淀完全溶解后，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570nm處測(cè)OD值。 3．流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC表面CD54、CD106的表達(dá)將培養(yǎng)后的HUVEC以1×10<'5>/ml的濃度接種于24孔板，待長(zhǎng)成單

5、層后，加入TNF-α50ng/ml為模型組；加入黃芩苷120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml預(yù)處理24h后，再加入TNF-α50ng/ml為黃芩苷高、中、低劑量組;并設(shè)立不加任何刺激物者為正常組；正常細(xì)胞加黃芩苷組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。放置37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。 上述24孔板內(nèi)的細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，加入鼠抗人CD54、CD106RPE，每管均設(shè)立同型對(duì)照，暗箱孵育25min后，

6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果CD54以平均熒光強(qiáng)度，CD106以熒光百分比表示。 4．脂多糖(LPS)和佛波酯(PMA)對(duì)HUVEC表達(dá)CD106的影響將培養(yǎng)后的HUVEC以1×10<'5>/ml的濃度接種于24孔板，待長(zhǎng)成單層后，分別加入5個(gè)不同濃度的LPS、PMA，依次為80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml：并設(shè)立不加任何刺激物者為正常組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。放置37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱內(nèi)

7、培養(yǎng)24h。 上述24孔板內(nèi)的細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，加入鼠抗人CD106RPE，每管均設(shè)立同型對(duì)照，暗箱孵育25min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果CD106以熒光百分比表示。 5．TNF-α對(duì)HUVEC凋亡的誘導(dǎo)作用培養(yǎng)后的HUVEC以1×10<'5>/ml的濃度接種于24孔板，待長(zhǎng)成單層后，加入5個(gè)不同濃度的TNF-α，依次為400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng

8、/ml，并設(shè)立不加任何刺激物者為正常組，分別培養(yǎng)24h。 上述24孔板內(nèi)的細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，按Annexin/PI試劑盒的說(shuō)明書處理細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，結(jié)果以凋亡百分率表示。 6．流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率培養(yǎng)后的HUVEC以1x10<'5>/ml的濃度接種于24孔板，待長(zhǎng)成單層后，加入TNF-α100ng/ml為模型組；加入黃芩苷120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml預(yù)處理24

9、h后，再加入TNF-α為黃芩苷高、中、低劑量組；并設(shè)立不加任何刺激物者為正常組；正常細(xì)胞加黃芩苷組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。放置37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。 上述24孔板內(nèi)的細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，按．AnnexinV/PI試劑盒的說(shuō)明書處理細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，結(jié)果以凋亡百分率表示。 7．統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS11.0軟件包的方差分析(ANOVA)模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間兩兩

10、比較采用LSD法。 抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)×100％ 結(jié)果： 1．在倒置顯微鏡下觀察HUVEC為貼壁細(xì)胞，呈三角形、多角形、梭形或多邊形，“鋪路石”樣緊密鑲嵌排列。感染TNF-α24h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。 2．TNF-α刺激24h的HUVEC細(xì)胞增殖，與正常組比較有降低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；單獨(dú)黃芩苷(120μg/ml)對(duì)正常細(xì)胞的增殖無(wú)影響；黃芩苷高劑量對(duì)HUVEC的增殖

11、有促進(jìn)作用，促增殖率為16％，且P<0.05。 3．TNF-α刺激24h的HUVEC表面黏附因子CD54的平均熒光強(qiáng)度增加約1.6倍，單獨(dú)黃芩苷(120μg/ml)組對(duì)正常細(xì)胞的CD54無(wú)影響；黃芩苷高劑量、中劑量組可有效降低TNF-α誘導(dǎo)的CD54的表達(dá)，抑制率分別為41％、15％。TNF-α對(duì)HUVEC表面黏附因子CD106的表達(dá)無(wú)明顯影響。 4．LPS、PMA刺激24h的HUVEC表面黏附因子CD106的熒光百分比

12、，與正常組比較無(wú)差別。 5．TNF-α可誘導(dǎo)HUVEC凋亡，在濃度為100 ng/ml，作用時(shí)間24h時(shí)，凋亡率最高，為正常組的約2.4倍。 6．黃芩苷高劑量組可抑制TNF-α誘導(dǎo)的凋亡率的增加，抑制率為38％。 結(jié)論： TNF-α刺激HUVEC后，細(xì)胞表面黏附因子CD54增加，細(xì)胞凋亡率亦明顯增加，但對(duì)CD106的表達(dá)無(wú)明顯影響。說(shuō)明TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用一方面是誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面黏附因子(CD54

13、)的表達(dá)增加，另一方面可能與直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。LPS和PMA對(duì)CD106的表達(dá)也無(wú)明顯影響。 中藥黃芩苷對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的黏附因子表達(dá)有一定的抑制作用，同時(shí)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的凋亡率增加也有降低效果，體現(xiàn)了黃芩苷在抗炎、抗凋亡方面的作用。 本研究從黏附因子、細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面，采用流式細(xì)胞術(shù)、MTT法，探討了TNF-α對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，為AS的慢性炎癥學(xué)說(shuō)提供了細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 黃芩苷降低TNF-α誘導(dǎo)的