高尿酸對TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)的影響及機制研究.pdf

1、尿酸是鳥嘌呤和腺嘌呤代謝的主要代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能，當病理情況下，尿酸水平持續(xù)升高，誘發(fā)炎癥反應(yīng)、白細胞激活導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，尿酸不同程度的升高是糖尿病和冠心病的危險因素之一，但是尿酸能否作為獨立的危險因素，參與疾病的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后仍有較大爭議。近年來的國內(nèi)外的研究提示，在穩(wěn)定性心絞痛患者中，尿酸不同程度的升高與疾病的預(yù)后無明顯相關(guān)，在急性冠脈綜合征患者中，高尿酸血癥與疾病的再發(fā)和死亡存在明顯關(guān)系，但是

2、與冠脈血管的嚴重程度沒有關(guān)系。本課題前期臨床研究也顯示，急性冠脈綜合征患者尿酸水平升高與其的預(yù)后相關(guān)，生存分析模型顯示，尿酸水平在500-600μmmol/L時，冠心病患者的預(yù)后較差。尿酸與冠心病的關(guān)系與其它傳統(tǒng)危險因素如高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙相比，其對心血管疾病的影響是單獨起作用還是協(xié)同其他因素作用仍不清楚。目前國內(nèi)外對于尿酸的研究多停留在臨床分析和少量的體外細胞實驗，對于高尿酸環(huán)境對內(nèi)皮細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)的影響及其相關(guān)的機制并不

3、明了，有待進一步研究。
　　目的：
　　研究不同濃度尿酸對TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)的影響及其可能的相關(guān)機制。
　　對象和方法：
　　1.研究對象
　　人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)。
　　2.研究方法
　　2.1 培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，用第4-6代的細胞用于實驗。
　　2.2 用CCK-8試劑盒及MTT試劑盒測定不同濃度尿酸對于人臍靜脈血管細胞的毒性和細胞增殖的影響。

4、>　　2.3 不同濃度尿酸及TNF-α預(yù)處理處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞:根據(jù)我們前期收集的冠心病人的臨床資料，將高尿酸水平進行分層冠心病人群尿酸水平輕度升高平均值480μmmol/L，冠心病人群高尿酸水平的中度升高平均值590μmmol/L，冠心病人群高尿酸水平高度升高平均值700μmmol/L，確定用80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL的尿酸處理細胞，同時用10ng/mL的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基處理。利

5、用人腫瘤壞死因子-α（hTNF-α，10ng/ml）做為陽性對照。
　　H1:0ng/ml，對照組
　　H2:hTNF-α:10ng/ml，陽性對照組
　　H3:尿酸80μg/mL（冠心病人群高尿酸水平的輕度升高平均值）+hTNF-α(10ng/ml)組
　　H4:尿酸100μg/mL（冠心病人群高尿酸水平的中度升高平均值）+hTNF-α(10ng/ml)
　　H5:尿酸120μg/mL（冠心病人群高尿酸水

6、平的高度升高平均值）+hTNF-α(10ng/ml)組
　　2.4 過氧化氫試劑盒測定細胞外過氧化氫(H2O2)和用熒光酶標儀測定細胞內(nèi)活性氧。
　　2.5 用ELISA測定ET-1(endothelin-1)、TF(tissue factor)等因子蛋白水平的表達。
　　2.6 用q-PCR測定ET-1、TF等因子mRNA水平的表達。
　　2.7 用Western Blotting測定炎癥因子ICAM-1、VC

7、AM-1、IL-18的表達和信號通路蛋白t/p-IKKα，t/p-IκBα和內(nèi)參蛋白β-actin的表達。
　　3.統(tǒng)計方法
　　使用版本為19.0的SPSS統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)形式為均數(shù)±標準差。采用單因素方差分析的方法對各實驗組和對照組進行比較。P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.當尿酸濃度在80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL時HU

8、VEC的細胞活力未出現(xiàn)明顯下降(P＞0.05)，表明這三個濃度對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的活力基本無影響，當尿酸濃度在200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL時人臍靜脈內(nèi)皮細胞的活力則顯著下降(P＜0.05)。
　　2.H2O2在H1、H2、H3、H4、H5這五個組的表達為2.46±0.25μmmol/L、3.70±0.07μmmol/L、4.75±0.02μmmol/L、5.20±0.23μmmol/L、3.72±0.2

9、6μmmol/L。與H2組相比，H3、H4組中H2O2的分泌明顯高于H2組(P＜0.05);細胞內(nèi)活性氧(ROS)的OD值在H1、H2、H3、H4、H5組分別為36.5±6.1、638.2±26.8、1196.5±74、1400.8±111、888.2±87.2。與H2組相比，H3、H4組中ROS的分泌明顯高于H2組(P＜0.01)，表明尿酸能促進TNF-α誘導(dǎo)的細胞內(nèi)活性氧和細胞外過氧化氫的產(chǎn)生。
　　3.ET-1在H1、H2、

10、H3、H4、H5組表達分別為199.2±13.0pg/mL、802.6±72.7pg/mL、1134.4±135.0pg/mL、1255.6±275.4pg/mL、463.1±147.0pg/mL。與H2組相比，H3、H4組中ET-1的分泌明顯高于H2組(P＜0.05);TF在H1、H2、H3、H4、H5組表達分別為74.5±7.6pg/mL、142.0±15.0pg/mL、211±26.0pg/mL、250±37.3pg/mL、254

11、.4±30.2pg/mL的水平升高。與H2組相比，H3、H4、H5組中TF的分泌明顯高于H2組(P＜0.01);ET-1、TF在mRNA水平的變化與其蛋白水平變化基本相符合，表明尿酸能使TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)水平升高。與H2組相比，H3、H4、H5組中VCAM-1的分泌明顯高于H2組(P＜0.01)。與H2組相比，H4、H5組中ICAM-1的分泌明顯高于H2組(P＜0.01)。與H2組相比，H3、H4組中IL-18的分泌明顯高