醛糖還原酶在高尿酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷中的作用研究.pdf

1、研究背景：高尿酸血癥是獨(dú)立于高血壓、糖尿病、肥胖等危險(xiǎn)因素之外的引發(fā)心血管疾病和慢性腎臟病的危險(xiǎn)因素。尿酸最初在體內(nèi)是作為抗氧化劑出現(xiàn)的，為什么尿酸在高濃度下轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺趸?目前認(rèn)為高尿酸導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)是由氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的，但該過程是如何啟動(dòng)的?文章中我們將通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)尋找高尿酸刺激肉皮細(xì)胞后可能的炎癥反應(yīng)途徑。
　　目的：探討高濃度尿酸導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的作用機(jī)制。
　　方法：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC

2、s)用含10％FBS的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，尿酸刺激終濃度為600μmol/L，刺激24h。使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(SILAC)聯(lián)用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析策略篩選高尿酸條件下內(nèi)皮細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白，其中醛糖還原酶(aldose reductase，AR)顯著上調(diào)，隨后用Western Blot等驗(yàn)證了該結(jié)果。
　　HUVECs分對照組、正常濃度尿酸組(300μmol/L)和高尿酸(600μmol/L)組，刺

3、激24h，激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)總ROS及其組分(O2·-、H2O2、1O2、·OH)和ONOO-的變化情況。酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO水平變化。后在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上使用AR抑制劑，再次檢測ROS及NO水平，并觀察AR抑制劑與NADPH氧化酶可能相互關(guān)系。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：野生型雄性C57BL/6小鼠和C57BL/6來源的雄性AR-/-鼠分別制作高尿酸血癥模型，野生型C57BL/6小鼠在造模過程中不同分組分別給予AR抑制劑Epa

4、lrestat、O2·-清除劑PEG-SOD、H2O2清除劑Catalase治療，采血檢測UA、NO、vWF和H2O2。AR-/-小鼠也采血檢測UA、NO和vWF。
　　結(jié)果：我們用高濃度尿酸培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，利用SILAC/LC-MS，共篩選出差異蛋白39個(gè)，其中AR表達(dá)顯著上調(diào)，因AR與氧化應(yīng)激的明確關(guān)聯(lián)引起我們的注意，隨后用Western Blot驗(yàn)證了該結(jié)果。
　　我們用激光共聚焦顯微鏡檢測不同濃度尿酸刺激后內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)R

5、OS及其組分表達(dá)。發(fā)現(xiàn)生理濃度尿酸刺激內(nèi)皮細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)總ROS、O2·-、1O2、·OH表達(dá)下調(diào)，H2O2表達(dá)上調(diào)；如果用高濃度尿酸刺激內(nèi)皮細(xì)胞則細(xì)胞內(nèi)總ROS、O2·-、·OH、H2O2表達(dá)上調(diào)，1O2表達(dá)下調(diào)。提示高濃度尿酸保留部分抗氧化能力，但喪失降低O2·-、H2O2和·OH的能力。因O2·-可快速向H2O2轉(zhuǎn)化，而·OH半衰期極短，考慮H2O2可能為高尿酸介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙主要ROS成分。細(xì)胞上清液NO水平表達(dá)下降為炎癥反應(yīng)

6、存在重要指標(biāo)。使用過氧化氫酶特異清除H2O2可減輕細(xì)胞炎癥損傷。
　　HUVECs予AR抑制劑預(yù)處理后加高尿酸刺激，與高尿酸組比較，細(xì)胞內(nèi)總ROS降低，NO水平升高。AR抑制劑也抑制NADPH氧化酶激活，提示高尿酸可能首先激活A(yù)R途徑，進(jìn)而提高NADPH氧化酶來源ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
　　為驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們使用野生型雄性C57BL/6小鼠制作高尿酸血癥模型，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)高尿酸血癥模型組血清H2O2升高，與體外