過氧化物氧化還原酶1在LPS誘導(dǎo)急性肺損傷中的功能和作用.pdf

1、背景:
　　急性肺損傷（ALI）及其嚴(yán)重階段急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性的、進行性的呼吸衰竭。ALI基礎(chǔ)病因多樣，其中感染是其主要原因之一。在重癥感染中，致病菌以革蘭陰性菌(G-)占多數(shù)。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌的主要致病成分,抗菌藥物在殺菌抑菌的同時會誘導(dǎo)內(nèi)毒素的產(chǎn)生,增加了疾病的治療難度。ALI時肺內(nèi)多種細胞參與炎癥過程，其本質(zhì)是一種促炎因素和抗炎因素失衡引發(fā)的炎癥反應(yīng)，多種炎癥介質(zhì)和細

2、胞因子參與發(fā)病。肺內(nèi)上皮細胞損傷是急性肺損傷發(fā)生過程中的重要事件,肺上皮細胞不僅作為肺臟的被動生理屏障起到防止外界有害物質(zhì)的侵入的作用,而且在肺臟的先天性免疫反應(yīng)中扮演重要的角色。在ALI的發(fā)生發(fā)展的眾多環(huán)節(jié)中，氧化應(yīng)激反被認為是ALI/ARDS的重要發(fā)病機制之一，氧化反應(yīng)過度產(chǎn)生的氧自由基可直接攻擊組織細胞、活化免疫細胞進一步加重炎癥。
　　過氧化物氧化還原酶1（peroxiredoxin1,prdx1）屬于抗氧化蛋白超家族中的

3、2-Cysprdx，其在細胞內(nèi)的主要功能是還原過氧化氫發(fā)揮抗氧化和自由基清除作用。過去的研究中主要集中于prdx1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，近幾年國內(nèi)外有研究證明過氧化物氧化還原酶家族蛋白與急性肺損傷相關(guān)，但在炎癥過程中的具體功能和生物學(xué)特性仍不清楚。為研究prdx1蛋白在急性肺損傷炎癥中的功能，本實驗以氣道上皮細胞炎性損傷為模型，通過構(gòu)建人prdx1蛋白真核表達載體進行基因轉(zhuǎn)染，使prdx1蛋白在BEAS-2B細胞中沉默表達或穩(wěn)定高表達

4、，然后檢測NFΚB激活轉(zhuǎn)錄和炎性細胞因子的水平，探討prdx1蛋白在炎癥調(diào)控過程中的作用。
　　目的:
　　用LPS誘導(dǎo)氣道上皮細胞BEAS-2B高表達Peroxiredoxin1（prdx1，過氧化物氧化還原酶1），并探討Peroxiredoxin1在急性肺損傷過程中調(diào)節(jié)炎癥因子的作用。
　　方法:
　　1，不同來源LPS（大腸桿菌，銅綠假單胞菌）作用beas-2b細胞后，隨著LPS作用濃度的增加，prdx1-

5、mRNA和蛋白的表達亦隨之增加，且呈劑量依賴性，不同濃度組間比較有明顯差異。推測prdx1參與參與調(diào)節(jié)炎癥過程，可能作為觀察疾病發(fā)展過程的觀察指標(biāo)；
　　2，構(gòu)建prdx1-pMSCV質(zhì)粒，prdx1mRNA編碼區(qū)序列克隆至pMSCV載體上，轉(zhuǎn)染至BEAS-2B細胞內(nèi)，檢測prdx1-mRNA，prdx1蛋白；細胞核內(nèi)P50、P65；和細胞炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α的表達。
　　3，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo

6、-shRNA-prdx1質(zhì)粒，設(shè)計shRNA,克隆至pGPU6/GFP/Neo載體，測序驗證后轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞；檢測prdx1-mRNA，prdx1蛋白；細胞核內(nèi)P50、P65蛋白和細胞炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-αRNA的表達。
　　結(jié)果:
　　1，隨著LPS作用濃度的增加，氣道上皮細胞prdx1-mRNA和蛋白的表達亦隨之增加，不同濃度組間比較有明顯差異；細胞核內(nèi)P50，P65表達增加；LPS；IL-1β，

7、IL-6，IL-8，TNF-α等炎癥介質(zhì)的高表達；
　　2，Prdx1-pMSCV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)后，細胞內(nèi)高表達prdx1，Prdx1蛋白增加引起核內(nèi)P50、P65增加；且引起炎癥介質(zhì)的表達增加；
　　3，ShRNA-prdx1-531轉(zhuǎn)染后沉默prdx1蛋白的表達；抑制prdx1蛋白表達后，在LPS刺激條件下核內(nèi)P50、P65水平降低，炎癥介質(zhì)的表達降低。
　　結(jié)論:
　　1，prdx1蛋白有可能作為急性肺損