過(guò)氧化物酶增殖體激活受體-α、γ激活劑在急性肺損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的： 急性肺損傷(ALI)是臨床常見(jiàn)的危重癥，死亡率高，以炎癥反應(yīng)和肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為主要病理改變。已有研究表明，ALI本質(zhì)是一種炎癥；多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子在內(nèi)毒素性ALI病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前臨床對(duì)ALI治療雖已采取多種積極措施，但尚未取得突破性進(jìn)展。最近研究表明，過(guò)氧化物酶增殖體激活受體(peroxisomeproliferators-activatedreceptors，PPARs)具有抗炎作用，故我們

2、推測(cè)：PPARs對(duì)ALI的肺組織可能具有一定程度的保護(hù)作用，而PPARs在ALI病程中的基因、蛋白表達(dá)及其對(duì)炎癥是否具有保護(hù)作用尚待研究。PPARs有三種亞型，即PPAR-α、PPAR-β/δ(亦稱PPARδ或NUC1)和PPAR-γ。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)其中兩種亞型PPAR-α、PPAR-γ進(jìn)行相關(guān)研究：采用靜脈注射脂多糖(LPS)復(fù)制大鼠ALI模型后，觀察PPAR-α、PPAR-γ在ALI肺組織的表達(dá)情況；然后，分別采用PPAR-α、PP

3、AR-γ的激活劑、拮抗劑、激活劑和拮抗劑聯(lián)合以及此二激活劑聯(lián)合對(duì)大鼠ALI模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)大鼠內(nèi)毒素性ALI肺組織表達(dá)PPAR-α、PPAR-γ的影響以及其在ALI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的保護(hù)作用。為臨床應(yīng)用PPAR-α、PPAR-γ激活劑治療內(nèi)毒素性ALI提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 采用頸靜脈注射LPS的方法復(fù)制大鼠內(nèi)毒素性ALI模型，按完全隨機(jī)原則將216只Wistar。大鼠分入正常對(duì)照組(ND組)、脂多糖致傷組

4、(LD組)、wyl4643處理組(LW組)、Troglitazone處理組(LT組)，MK886處理組(LM組)、GW9662處理組(LG組)，wy14643+MK886處理組(LWM組)，Troglitazone+GW9662處理組(LFG組)，wy44643+Troglitazone處理組(LWT組)，每組分為1h、2h、4h、8h四個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只老鼠。具體方法：對(duì)照組(ND組)靜脈注射10％DMSO3ml/kg，30mi

5、n后注射生理鹽水2.5ml/kg；致傷組(LD組)大鼠經(jīng)靜脈注射10％：DMSO3.ml/kg，30min后注射LPS5mg/kg(溶于生理鹽水)；各處理組分別先給大鼠靜脈注射wy146433mg/kg(溶于10％DMSO)、Troglitazone3mg/kg(溶于10％DMSO)、MK8863mg/kg(溶于10％DMSO)、GW96621mg/kg(溶于10％DMSO)、wy146433mg/kg+MK8863mg/kg(間隔15

6、min)、Troglitazone3mg/kg+GW96621mg/kg(間隔15min)、wy146433mg/kg+Troglitazone3mg/kg(間隔15min)，然后間隔30min后，再給大鼠靜脈注射LPS5mg/kg(于注射LPS完畢后開(kāi)始計(jì)時(shí))。在1h、2h、4h、8h時(shí)相點(diǎn)活殺大鼠。采集各組大鼠標(biāo)本，測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)和肺組織濕干重比(W/D)；鄰連茴香胺法測(cè)定肺組織MPO活性；采用半定量RT-PCR方法測(cè)

7、定肺組織中PPAR-amRNA、PPAR-γTmRNA以及TNF-αmRNA的表達(dá)水平；免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定肺組織PPAR-α和PPAR-γ蛋白表達(dá)水平；ELISA法測(cè)定肺組織勻漿上清和血漿中TNF-α濃度水平；WesternBlot法檢測(cè)肺組織胞核蛋白中NF-κBP65蛋白的活性；并進(jìn)行肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果： 1.正常對(duì)照組大鼠肺組織有PPAR-α和PPAR-γ表達(dá)，均主要分布在肺泡上皮細(xì)胞；LPS致傷組大鼠

8、PPAR-α和PPAR-γmRNA及蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。 2.Wy14643和Troglitazone分別使ALI肺組織中PPAR-α和PPAR-γmRNA及蛋白表達(dá)在各時(shí)相點(diǎn)較LPS致傷組有不同程度升高，以2h、4h升高最顯著(P＜0.05)；Wy14643+MK886、Troglitazone+GW9662使ALI肺組織中PPAR-α和PPAR-γmRNA及蛋白表達(dá)在各時(shí)相點(diǎn)較正常組有不同程度降低(P＜

9、0.05)，但與LD組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。MK886使ALI肺組織中PPAR-αmRNA及蛋白表達(dá)在各時(shí)相點(diǎn)較Wy14643+MK886組進(jìn)一步降低(P＜0.01)；GW9662使ALI肺組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達(dá)在各時(shí)相點(diǎn)較Troglitazone+GW9662組進(jìn)一步降低(P＜0.01)。 3.wy14643+Troglitazone使ALI肺組織中PPAR-α和PPAR-γ,mRNA及蛋白表達(dá)在各時(shí)相

10、點(diǎn)較LPS致傷組有不同程度升高(P＜0.05)；與Wy14643、Troglitazone單獨(dú)干預(yù)組比較，PPAR-α和PPAR-γmRNA及蛋白在各時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 4.Wy14643和Troglitazone均能在各時(shí)相點(diǎn)顯著抑制ALI肺組織中TNF-αmRNA表達(dá)，抑制肺組織和血漿中TNF-α蛋白的表達(dá)(P＜0.05)；Wy14643+MK886、Troglitazone+GW9662較正常組增強(qiáng)

11、ALI肺組織中TNF-αmRNA和肺組織、血漿中TNF-α蛋白表達(dá)(P＜0.05)，與LD組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。MK886和GW9662均使各時(shí)相點(diǎn)ALI肺組織中TNF-αmRNA表達(dá)分別較Wy14643+MK886組、Troglitazone+GW9662組增強(qiáng)，使肺組織和血漿中TNF-α蛋白的表達(dá)增高(P＜0.05)。 5.Wy14643+Troglitazone組較單獨(dú)使用Wy14643和Troglitazon

12、e組進(jìn)一步抑制ALⅠ組織中TNF-αmRNA表達(dá)和肺組織、血漿中TNF-α蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。 6.LPS致傷組大鼠肺組織中NF-кB明顯活化；單獨(dú)使用Wy14643、Troglitazone處理均顯著抑制各時(shí)相點(diǎn)ALI肺組織中NF-кB的活化(P＜0.05)；Wy14643+MK886、Troglitazone+GW9662組對(duì)NF-кB的活化與LD組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)；而單獨(dú)使用MK886、GW9662使

13、各時(shí)相點(diǎn)ALI肺組織中NF-кB的活化進(jìn)一步增強(qiáng)(P＜0.05)。 7.Wy14643+Troglitazone組各時(shí)相點(diǎn)較單獨(dú)使用Wy14643、Troglitazone組進(jìn)一步抑制ALI肺組織中NF-кB活化(P＜0.05)。 8.單獨(dú)使用Wy14643、Troglitazone能改善PaO2、大鼠肺組織W/D比值、肺組織病理積分，抑制肺組織MPO活性(P＜0.05)；使用拮抗劑MK886、GW9662使上述作用減輕

14、(P＜0.05)；wy14643+Troglitazone聯(lián)合使用使PaO2、W/D比值、病理積分較Wy14643、Troglitazone單獨(dú)使用進(jìn)一步改善(P＜0.05)，肺組織MPO活性顯著受抑。 結(jié)論： 1.LPS復(fù)制的ALI大鼠模型中，肺組織PPAR-α和PPAR-γ，表達(dá)顯著減少，提示PPAR-α和PPAR-γ可能參與ALI的炎癥反應(yīng)。 2.Wy14643顯著上調(diào)ALI大鼠肺組織PPAR-αmRNA和

15、蛋白的表達(dá)；Troglitazone顯著上調(diào)ALI大鼠肺組織PPAR-γmRNA和蛋白的表達(dá)；Wy14643和Troglitazone聯(lián)合作用顯著上調(diào)ALI大鼠肺組織PPAR-αmRNA、PPAR-γmRNA及其蛋白的表達(dá)，但較激活劑單獨(dú)使用無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 3.Wy14643和Troglitazone通過(guò)阻止NF-кB的活化，抑制TNF-α基因和蛋白的表達(dá)，降低肺組織MPO活性，對(duì)ALI肺組織起到一定程度的保護(hù)作用