過氧化物酶體增殖物激活受體α對急性肝衰竭的保護(hù)作用與機(jī)制.pdf

1、目的:急性肝衰竭是一種由炎癥介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷過程，預(yù)后極差，其器官損傷的免疫學(xué)機(jī)制尚未完全闡明，尋求新的治療方法一直是該病研究的熱點和難點。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorα，PPARα)是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，已被證實參與了細(xì)胞脂質(zhì)代謝、凋亡及炎癥反應(yīng)等。盡管多項研究表明PPARα具有明確的抗炎作用，但在炎癥作為其主要病生理機(jī)制的急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中

2、，PPARα的作用及機(jī)制如何目前國內(nèi)外尚無研究報道。本研究的目的在于探討PPARα對急性肝衰竭的保護(hù)作用與機(jī)制。
　　方法:本實驗共分如下兩部分。
　　1、動物實驗
　　通過D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）聯(lián)合脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）腹腔注射構(gòu)建小鼠急性肝衰竭模型，檢測PPARα在疾病進(jìn)展過程中的動態(tài)表達(dá)變化及組織分布情況;給予PPARα的選擇性激動劑Wy-1

3、4，643干預(yù)，觀察PPARα對小鼠急性肝衰竭是否具有保護(hù)作用;分別用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)及自噬相關(guān)基因7的小干擾RNA(smallinterferingRNAagainstautophagyrelatedgene7，siAtg7)抑制細(xì)胞自噬，觀察自噬受抑后能否逆轉(zhuǎn)PPARα對小鼠急性肝衰竭的原有保護(hù)作用，以深入探討PPARα對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭的作用機(jī)制。組織病理

4、學(xué)分析及血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性測定觀察肝組織損傷的嚴(yán)重程度;實時定量PCR(RealTime-PCR)檢測PPARα、促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)、趨化因子(CXCL-1、CXCL-10)、自噬相關(guān)基因(ATG-5、ATG-7、LAMP-1)的mRNA表達(dá);蛋白印跡法(WesternBlot)檢測PPARα、炎癥信號通路相關(guān)蛋白（p-NF-κBp65、p-JNK、p-ERK、p-P

5、38）、自噬相關(guān)蛋白（LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1）的蛋白表達(dá)。
　　2、原代細(xì)胞實驗
　　通過LPS刺激小鼠骨髓來源的原代巨噬細(xì)胞(Bonemarrowderivedmacrophage，BMM)制作原代細(xì)胞炎癥模型，給予Wy-14，643干預(yù)，從細(xì)胞學(xué)水平觀察PPARα活化能否誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制炎癥反應(yīng);分別用3-MA、siAtg7抑制細(xì)胞自噬，觀察自噬受抑后能否逆轉(zhuǎn)PPARα的原有抗炎作用，以進(jìn)一步探討

6、PPARα對急性肝衰竭發(fā)揮保護(hù)作用的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。向原代巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒并于熒光顯微鏡下觀察以檢測自噬小體的形成情況;RealTime-PCR檢測促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)、趨化因子(CXCL-1、CXCL-10)的mRNA表達(dá);WesternBlot檢測自噬相關(guān)蛋白(LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、PPARα在急性肝衰竭時表達(dá)受抑，肝組織PP

7、ARα的mRNA和蛋白表達(dá)水平在急性肝衰竭疾病進(jìn)展過程中逐漸降低。
　　2、PPARα活化促進(jìn)了細(xì)胞自噬，抑制了急性肝衰竭時的炎癥反應(yīng)，對急性肝衰竭產(chǎn)生保護(hù)作用。與急性肝衰竭模型組相比，PPARα的選擇性激動劑Wy-14，643干預(yù)組小鼠肝大體形態(tài)接近于正常的肝臟，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，部分肝細(xì)胞呈氣球樣變，小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤不明顯，血清ALT、AST水平降低，促炎性細(xì)胞因子、趨化因子的mRNA及磷酸化的NF-κBp65、ERK、

8、JNK蛋白表達(dá)減少;自噬相關(guān)基因ATG-5、ATG-7、LAMP-1和蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1表達(dá)增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3、抑制自噬后加重了急性肝衰竭時的肝臟損傷和炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)了PPARα對急性肝衰竭的原有保護(hù)作用。分別用3-MA、siAtg7抑制自噬后，小鼠肝呈黝黑色，肝細(xì)胞大片狀壞死，肝索解離，肝小葉結(jié)構(gòu)無法辨認(rèn)，匯管區(qū)及壞死區(qū)可見大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，血清ALT、AST

9、水平升高，促炎性細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4、在原代巨噬細(xì)胞炎癥模型中，PPARα活化抑制了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而且PPARα的抗炎作用具有劑量依賴性。RealTime-PCR結(jié)果顯示分別用10μM、25μM、50μM的Wy-14，643干預(yù)LPS誘導(dǎo)的原代巨噬細(xì)胞炎癥模型，觀察到促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及趨化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表達(dá)逐漸減少，表明PPA

10、Rα活化可抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且PPARα的抗炎作用具有劑量依賴性。
　　5、在原代巨噬細(xì)胞炎癥模型中，PPARα活化促進(jìn)了細(xì)胞自噬，而且PPARα對自噬的誘導(dǎo)作用具有劑量依賴性。我們分別用10μM、25μM、50μM的Wy-14，643干預(yù)已轉(zhuǎn)染入GFP-LC3質(zhì)粒的原代巨噬細(xì)胞并于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)隨著Wy-14，643干預(yù)濃度的增加，原代巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成逐漸增多;WesternBlot結(jié)果顯示隨著Wy-14，643

11、干預(yù)濃度的增加自噬相關(guān)蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1的表達(dá)逐漸增多，說明PPARα活化可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，且PPARα對自噬的誘導(dǎo)作用具有劑量依賴性。
　　6、細(xì)胞自噬受抑后，逆轉(zhuǎn)了PPARα的原有抗炎作用，加劇了LPS誘導(dǎo)的原代巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。RealTime-PCR結(jié)果顯示與單用Wy-14，643激活PPARα相比，在加用3-MA、siAtg7抑制細(xì)胞自噬后，原代巨噬細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β

12、、IL-6及趨化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表達(dá)增加，說明細(xì)胞自噬受抑可使PPARα的原有抗炎作用不復(fù)存在。
　　結(jié)論:
　　1、PPARα在急性肝衰竭的疾病進(jìn)展過程中表達(dá)受抑。
　　2、PPARα活化通過促進(jìn)細(xì)胞自噬減輕肝組織的炎癥反應(yīng)，對急性肝衰竭產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　3、抑制自噬可加重急性肝衰竭時的肝臟損傷及肝組織的炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)PPARα對急性肝衰竭的原有保護(hù)作用。
　　4、PPARα可