過氧化物酶體增殖物激活受體γ在COPD氣道炎癥及肺氣腫形成中的作用和機(jī)制.pdf

1、COPD是一種以不完全可逆氣流受限為表現(xiàn)的慢性氣道炎癥性疾病，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)有害氣體或顆粒，特別是吸煙所致的異常慢性氣道炎癥相關(guān)。慢性支氣管炎和肺氣腫是其病理基礎(chǔ)，蛋白酶/抗蛋白酶失衡是其重要發(fā)病原因之一，尋找蛋白酶/抗蛋白酶失衡上游調(diào)解途徑并加以干預(yù)可能對(duì)疾病的發(fā)展起到延緩作用。
　　過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是

2、配體調(diào)控的核受體超家族成員之一，包含α、γ和β/δ三種亞型，其中PPAR-γ在正常人肺組織細(xì)胞及炎癥細(xì)胞上均有不同程度的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，PRAR-γ在多個(gè)器官和多種疾病中發(fā)揮抗炎癥、抗重建和抗增殖作用。目前，PPAR-γ在肺部炎癥中的作用越發(fā)受到關(guān)注，并已在動(dòng)物模型中證實(shí)，PPAR-γ激動(dòng)劑能減輕肺間質(zhì)纖維化、哮喘、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)引起的多器官功能衰竭及缺血-再灌注所致的肺損傷。但PPAR-γ在C

3、OPD肺部炎癥中的作用尚不清楚，明確PPAR-γ在COPD肺部炎癥中的作用及機(jī)制，可能為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　為了探討PPAR-γ在COPD慢性氣道炎癥和肺氣腫發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和COPD患者臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠肺氣腫模型，觀察PPAR-γ在香煙所致的肺氣腫中的表達(dá)變化，并應(yīng)用PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮激活PPAR-γ，觀察PPAR-γ表達(dá)對(duì)大鼠肺氣腫程度及肺組織MMP

4、-2、MMP-9表達(dá)的影響，另外，進(jìn)一步評(píng)價(jià)TLR-4和MAPK途徑是否參與到PPAR-γ對(duì)MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響。臨床試驗(yàn)中擬通過測(cè)定COPD患者誘導(dǎo)痰中的PPAR-γ水平與健康受試者進(jìn)行比較，觀察其水平的變化。同時(shí)評(píng)估PPAR-γ與MMP-9、MMP-9/TIMP-1之間的相關(guān)性。另外，評(píng)估上述指標(biāo)與COPD患者臨床指標(biāo)尤其是HRCT肺氣腫定量分析之間的相關(guān)性。
　　材料與方法:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(1)將24

5、只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、肺氣腫模型組、羅格列酮組，每組8只。模型組、羅格列酮組熏煙12周，羅格列酮組同時(shí)接受羅格列酮(30mg/kg)日一次灌胃。12周后處死大鼠，取材。(2)病理標(biāo)本的制備及形態(tài)定量分析:取每只大鼠的右下葉肺組織，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。對(duì)HE染色標(biāo)本進(jìn)行平均肺泡數(shù)、平均肺泡直徑和平均肺泡面積的測(cè)定。(3)采用免疫組織化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)PPAR-γ、 TLR-4、M

6、MP-9、MMP-2蛋白表達(dá)的情況。(4)采用Real-time PCR檢測(cè)PPAR-γ、 TLR-4、MMP-9、MMP-2 mRNA的水平。(5)采用Western blot檢測(cè)ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化水平的變化。(6)采用Western blot檢測(cè)磷酸化IK-Bα的蛋白表達(dá)。
　　2.臨床試驗(yàn):選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所隨訪的66例穩(wěn)定期COPD患者作為研究對(duì)象，同時(shí)選取12例不吸煙的健康

7、志愿者作為對(duì)照。所有受試者進(jìn)行肺功能檢查及留取誘導(dǎo)痰。COPD患者進(jìn)行肺HRCT檢查，并測(cè)定LAA％和肺氣腫體積百分比。進(jìn)行SGRQ、CAT、MMRC呼吸困難問卷，進(jìn)行6分鐘步行試驗(yàn)(6 minute walking test，6MWT)測(cè)定6分鐘步行距離(6 minute walkingdistance，6MWD)。依試劑盒說明采用ELISA方法測(cè)定誘導(dǎo)痰中PPARγ、 MMP-9、TIMP-1和MMP-9/TIMP-1表達(dá)情況

8、>　　結(jié)果:
　　1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(1)各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)比較:與對(duì)照組相比，模型組大鼠的MAN減少，MLI和MAA增大(p＜0.01)，肺氣腫模型復(fù)制成功。與模型組相比，羅格列酮能減輕肺氣腫的形成(p＜0.01)。(2)各組大鼠肺組織中PPAR-γ表達(dá)水平比較:免疫組化、Western blot和real-time PCR結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，模型組肺組織內(nèi)的PPAR-γ蛋白和mRNA表達(dá)下降(p＜0.01)。與模型組對(duì)比，

9、羅格列酮組PPAR-γ蛋白和mRNA表達(dá)顯著增高（p均＜0.01）。(3)各組大鼠肺組織中TLR-4的表達(dá)水平比較:免疫組化、Western blot和real-time PCR結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，模型組肺組織內(nèi)的TLR-4蛋白和mRNA表達(dá)增高(p＜0.01)。與模型組對(duì)比，羅格列酮組TLR-4蛋白和mRNA表達(dá)顯著減低（p均＜0.01）。(4)各組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平比較:免疫組化、Western bl

10、ot和real-time PCR結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，模型組肺組織內(nèi)的MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表達(dá)增高(p＜0.01)。與模型組對(duì)比，羅格列酮組MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低（p均＜0.01）。(5)各組大鼠肺組織中ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化水平比較:Western blot結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，模型組肺組織內(nèi)的ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化水平增高(p＜0.01)。

11、與模型組對(duì)比，羅格列酮組ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化水平下降(p＜0.05）。(6)各組大鼠肺組織中IK-Bα磷酸化水平比較:Western blot結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，模型組肺組織內(nèi)的IK-Bα磷酸化水平下(p＜0.01);與模型組對(duì)比，羅格列酮組IK-Bα磷酸化水平升高(p＜0.05)。
　　2、臨床試驗(yàn):(1)與健康受試者比較，COPD患者誘導(dǎo)痰中PPAR-γ和TIMP-1水平減低，MMP-9及MMP-9

12、/TIMP-1增高(p＜0.01)。伴有肺氣腫的患者和肺功能分級(jí)差的患者其誘導(dǎo)痰中PPAR-γ和TIMP-1水平減低，MMP-9及MMP-9/TIMP-1增高更為明顯。(2) COPD患者誘導(dǎo)痰中PPAR-γ與TIMP呈正相關(guān)(r=0.517，p＜0.001)，與MMP-9、MMP-9/TIMP-1呈負(fù)相關(guān)(MMP-9:r=-0.286，p=0.025;MMP-9/TIMP-1:r=-0.417，p=0.001);并且上述指標(biāo)與FEV1

13、、FEVI％、6MWD、BODE指數(shù)、LAA％和肺氣腫體積百分比等指標(biāo)相關(guān)。肺氣腫體積百分比與與PPAR-γ和TIMP-1呈負(fù)相關(guān)(PPARγ:r=-0.331，p=0.009; TIMP-1:r=-0.514，p＜0.001)，與MMP-9和MMP-9/TIMP-1正相關(guān)(MMP-9:r=0.579，p＜0.001;MMP-9/TIMP-1: r=0.666，p＜0.001)，即:肺氣腫的嚴(yán)重程度與PPAR-γ和TIMP-1呈負(fù)相關(guān)，

14、與MMP-9和MMP-9/TIMP-1正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠肺氣腫及慢性氣道炎癥，其下調(diào)了PPAR-γ的表達(dá)，引起大鼠肺組織內(nèi)IK-Bα磷酸化水平下降，TLR-4表達(dá)增加， ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化增強(qiáng)，使MMP-2、MMP-9表達(dá)增加。2、PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮通過活化PPAR-γ，實(shí)現(xiàn)對(duì)煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺組織內(nèi)MMP-2，MMP-9蛋白酶失衡的調(diào)節(jié)作用，減輕香煙煙霧誘導(dǎo)的肺氣腫

15、，其可能是通過抑制減低TLR-4表達(dá)及抑制ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化來實(shí)現(xiàn)這一作用。3、COPD患者誘導(dǎo)痰中PPAR-γ和TIMP-1較健康受試者的水平下降，而MMP-9、MMP-9/TIMP-1水平增高。伴有肺氣腫的COPD患者誘導(dǎo)痰中PPAR-γ、TIMP-1水平減低和MMP-9、MMP-9/TIMP-1水平增高更為明顯;誘導(dǎo)痰中PPAR-γ與TIMP-1呈正相關(guān)，與MMP-9、MMP-9/TIMP-1呈負(fù)相關(guān)，與肺