黃河鯉魚2-Cys型過(guò)氧化物還原酶基因的分子克隆、原核表達(dá)與活性分析.pdf

1、鯉魚是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，黃河鯉魚是鯉魚中的一個(gè)重要的地方品種。近年來(lái)，由于人類活動(dòng)因素的影響，如過(guò)度捕撈，濫捕濫殺，河流污染，天然繁殖基地被隔離以及黃河自然斷流等，這些因素嚴(yán)重破壞著黃河流域的生態(tài)平衡，使得黃河鯉魚的資源總量急劇下降。伴隨著黃河鯉魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，疾病發(fā)生頻繁，嚴(yán)重制約了黃河鯉魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，黃河鯉魚抗病研究越來(lái)越受到重視。過(guò)氧化物還原酶（Peroxiredoxin，Prx）是抗氧化酶家族成員之一，廣泛存在于各

2、種生物體內(nèi)，能夠通過(guò)消除細(xì)胞內(nèi)的烷基過(guò)氧化氫和過(guò)氧化氫等氧化攻擊，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。本文以我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚類黃河鯉魚為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)黃河鯉魚典型2-Cys Prx基因中的Prx3和Prx4進(jìn)行研究，目的是闡明抗氧化蛋白Prx在黃河鯉魚免疫系統(tǒng)中的作用機(jī)制，為魚類抗病防御機(jī)制的研究提供有效的理論依據(jù)。
　　依據(jù)NCBI中提供的鯉魚全基因組序列信息，采用RT-PCR方法，從黃河鯉魚肝臟中克隆得到Prx3和Prx4。Prx3基因

3、組全長(zhǎng)是2816bp，其中5，端不翻譯區(qū)（Untranslated Regions，UTR）為196bp，開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）為753bp，編碼250個(gè)氨基酸，推導(dǎo)其編碼蛋白的分子量是27.01kDa，理論等電點(diǎn)為8.25。Prx4基因組全長(zhǎng)是3475bp，其中開放閱讀框?yàn)?83bp，編碼260個(gè)氨基酸，推導(dǎo)其編碼蛋白的分子量是29.11kDa，理論等電點(diǎn)為5.98。Prx3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含29.

4、60％α-螺旋和7.20%β-折疊；Prx4二級(jí)結(jié)構(gòu)包含31.15%α-螺旋和10.77%β-折疊。對(duì)Prx3和Prx4進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，黃河鯉魚和其他所分析的魚類均含有共同的保守催化中心“FTFVCPTEI”和“GEVCPA”。經(jīng)序列對(duì)比及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析表明黃河鯉魚Prx3和Prx4與斑馬魚、新月魚、棘魚的過(guò)氧化物還原酶基因具有非常高的同源性。轉(zhuǎn)錄水平分析顯示，Prx3和Prx4基因在黃河鯉魚的12個(gè)組織（性腺、肝臟、肌肉、鰭、

5、魚鰾、眼、腦、鰓、脾臟、腸、腎臟、心臟）中均有表達(dá)，其中Prx3在腎臟中的表達(dá)量最高，肌肉次之，在鰭中表達(dá)量最低。Prx4在腎中的表達(dá)量最高，在性腺中的表達(dá)量較低于腎臟，在魚鰾中表達(dá)量最低。腹腔注射嗜水氣單胞菌后，提取其肝，脾和腎3個(gè)組織進(jìn)行表達(dá)變化分析，發(fā)現(xiàn)在不同的時(shí)間段這3個(gè)組織Prx3和Prx4都有明顯的變化。在感染6h后，肝臟和脾臟中的Prx3和Prx4的表達(dá)量顯著增加，之后逐漸下降。在腎臟中，感染6h后Prx3和Prx4的表達(dá)

6、量顯著下降，之后有上升趨勢(shì)。這顯示了Prx3和Prx4在黃河鯉魚遭受病原菌感染時(shí)具有較強(qiáng)的應(yīng)答水平。
　　擴(kuò)增Prx4基因的成熟肽后，Sal I、EcoR I雙酶切擴(kuò)增片段和原核表達(dá)載體pMAL-c5x，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pMAL-c5x-Prx4，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，目的基因正確插入表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入E.coli BL21中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒菌E.coli BL21/pMAL-c5x-Prx4，SDS-PAGE檢測(cè)表明，Prx4能在