紫花苜蓿過氧化物酶基因(MsPrx)的克隆及表達與轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、紫花苜蓿是優(yōu)良的豆科牧草，具有蛋白含量高、適口性強、產(chǎn)量高等優(yōu)點。中國西北地區(qū)是紫花苜蓿主要的種植區(qū)域，但是由于紫花苜蓿在西北地區(qū)經(jīng)常受不良環(huán)境的影響，極大的影響了其產(chǎn)量與品質(zhì)。因此獲得品質(zhì)更加優(yōu)良、抗逆性更強的紫花苜蓿品種對推動中國苜蓿種植業(yè)發(fā)展具有舉足輕重的作用。由于傳統(tǒng)的育種手段效率低，對紫花苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)的改良并沒有很大突破。轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有效率高、目的性強等優(yōu)點，并且已經(jīng)在多種植物上取得了矚目的成就，因此利用分子手段對苜蓿抗逆性

2、進行改良是十分有效的辦法。
　　本研究通過同源克隆的方法克隆了紫花苜蓿植物過氧化物酶MsPrx基因，并對該基因及蛋白序列進行了分析，對其分子功能進行了推測;通過實時熒光定量技術(shù)對MsPrx基因的不同組織以及NaCl、ABA處理后的基因表達水平進行了測定和分析;通過構(gòu)建瞬時表達載體對MsPrx基因進行了亞細(xì)胞定位;構(gòu)建了超表達載體并通過組織培養(yǎng)獲得了T0代轉(zhuǎn)基因煙草為后續(xù)進一步的研究提供了試驗材料。主要研究成果如下:
　　1.

3、根據(jù)蒺藜苜蓿中植物過氧化物酶基因序列設(shè)計引物，利用RACE法獲得紫花苜蓿中過氧化物酶基因MsPrx。經(jīng)過序列分析表明該基因全長1190bp，其中CDS區(qū)963bp，編碼320個氨基酸。蛋白序列分析表明該蛋白具有信號肽結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位預(yù)測為分泌途徑，因此MsPrx蛋白是分泌性過氧化物酶，屬于Class III植物過氧化物酶家族。
　　2.通過實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)MsPrx基因在苜蓿根、莖、葉中均有表達，但在葉中表達量最高，根中

4、表達量次之，莖中表達量最少。NaCl、ABA處理后MsPrx在根、莖、葉中的表達量均呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢，表明ABA可能作為信號因子調(diào)控MsPrx基因在NaCl脅迫下的表達。
　　3.克隆MsPrx完整的CDS區(qū)序列，去掉終止密碼子后插入到pCAMBIA1302-mGFP載體中，完成瞬時表達載體MsPrx-GFP的構(gòu)建。利用煙草葉片進行亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明MsPrx基因定位在參與分泌途徑的細(xì)胞器中，因此在植物抵抗脅迫方面可能具有