番茄類囊體膜抗壞血酸過氧化物酶基因的克隆及功能分析.pdf

1、逆境脅迫是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上面臨的嚴(yán)峻問題之一,也是蔬菜設(shè)施栽培中常見的問題,可導(dǎo)致作物生長發(fā)育受抑制,產(chǎn)量和品質(zhì)降低。當(dāng)作物生長的外在條件如溫度、土壤水分、鹽濃度等發(fā)生急劇變化或紫外線輻射、某些除草劑等作用于植物時(shí),都會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧。活性氧可引起蛋白質(zhì)、膜脂和其他細(xì)胞組分的損傷,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞及組織死亡。活性氧主要包括過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)、單線態(tài)氧(1O2)、超氧陰離子(O-2)等。葉綠體抗壞血酸過氧化

2、物酶(chlAPX)包括葉綠體基質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶(sAPX)和類囊體膜抗壞血酸過氧化物酶(tAPX)兩種,它對(duì)于保護(hù)葉綠體和其它細(xì)胞組分免受H2O2和由它產(chǎn)生的·OH破壞作用是必須的。因此研究逆境脅迫下APX基因與植物抗逆性的關(guān)系具有重要意義。 本研究從番茄葉片中克隆到LetAPX并轉(zhuǎn)化到煙草中,選用野生型煙草(WT),轉(zhuǎn)正義LetAPX基因株系后代T2-2(+)、T2-3(+)和T2-6(+),研究了逆境脅迫下過量表達(dá)Le

3、tAPX基因的煙草后代抗氧化及抗逆性能力的變化。表達(dá)模式和功能分析表明,LetAPX基因的表達(dá)受多種逆境誘導(dǎo),低溫、高溫、鹽脅迫、干旱、H2O2處理等逆境條件下過量表達(dá)對(duì)煙草具有保護(hù)作用。主要結(jié)果如下： 1.利用同源序列設(shè)計(jì)兼并引物,通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到葉綠體tAPX基因的中間片段,通過5'-RACE和3'-RACE分別克隆到5'片段和3'片段,拼接后設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增到全長1369 bp cDNA,編碼377個(gè)

4、氨基酸的多肽。同源序列比較發(fā)現(xiàn),番茄tAPX的序列與煙草、擬南芥的葉綠體APX基因的序列高度同源。該基因命名為LetAPX。 2.Northern雜交結(jié)果表明,常溫下tAPX在番茄葉片中表達(dá)水平最高,其次為幼果(青)、莖、花萼,根與花中表達(dá)量最少。表達(dá)分析表明LetAPX受低溫、高溫、鹽脅迫、水分、H2O2脅迫誘導(dǎo),其表達(dá)水平隨逆境處理時(shí)間的延長而變化。同時(shí),常溫下轉(zhuǎn)基因煙草植株中表達(dá)水平高于野生型。 3.構(gòu)建pBI-L

5、etAPX正義表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草。利用卡那篩選,結(jié)合基因組DNA-PCR方法篩選得到轉(zhuǎn)基因植株。測定了低溫、高溫、鹽脅迫、干旱、H2O2處理等脅迫條件下APX酶活性,H2O2含量,丙二醛(MDA)含量和葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化。無論是野生型還是轉(zhuǎn)基因煙草的APX活性都是先升高后降低,但轉(zhuǎn)基因植株APX活性顯著高于對(duì)照。‘同時(shí)逆境脅迫導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片中的H2O2含量、MDA含量和葉片相對(duì)電導(dǎo)率明顯增加,但在相同處理時(shí)間

6、上,轉(zhuǎn)基因植株的以上測定值均低于野生型,但轉(zhuǎn)基因煙草的APX酶活性和清除H2O2的能力顯著高于野生型,其膜脂過氧化程度較輕。結(jié)果表明LetAPX基因的過量表達(dá)有助于提高煙草的抗氧化能力。 4.測定了低溫、高溫、鹽脅迫、干旱、H2O2處理等脅迫條件下的種子發(fā)芽率,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率明顯高于野生型,可見轉(zhuǎn)LetAPX基因煙草種子具有-定的耐逆性。轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株在逆境脅迫和非脅迫(對(duì)照)條件下種植,脅迫條件下野生型植

7、株的總體生長受抑更明顯,且逆境處理降低了植株的鮮重和干重,野生型植株的鮮重、干重和生長情況明顯低于轉(zhuǎn)基因植株。 5.與對(duì)照(正常條件)相比,低溫、高溫、鹽脅迫、干旱、H2O2處理后,轉(zhuǎn)基因和野生煙草葉片的光合速率均下降,但野生型植株下降更明顯。同時(shí),逆境脅迫下PSII的光化學(xué)效率Fv/Fm持續(xù)下降,轉(zhuǎn)基因和野生型植株變化趨勢相同,但轉(zhuǎn)基因植株光化學(xué)效率比野生型要高。這些結(jié)果表明煙草中過量表達(dá)LetAPX在逆境條件下對(duì)光系統(tǒng)有保護(hù)