龍眼果皮過氧化物酶的分離純化及cDNA的克隆.pdf

1、POD是影響果實(shí)褐變的一種重要的酶，目前對POD的研究還只是停留在常規(guī)生理、生化的研究上，對相關(guān)的分子生物學(xué)研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以龍眼果皮為材料，對其中的POD進(jìn)行了分離純化、質(zhì)譜分析和cDNA克隆的研究。 經(jīng)過40％飽和度硫酸銨鹽析、StreamlinePhenyl柱、DE-52柱、PhenylSepharoseHighPerformance柱、Superdex200prepgrade柱層析，從龍眼果皮中分離得到了電泳純的PO

2、D。SDS-PAGE結(jié)果顯示，分離得到的POD亞基表觀分子量約為48KD左右；精確分子量測定顯示，其分子量為45.65KD；分子篩分子量測定結(jié)果顯示整蛋白分子約為45KD左右，表明分離得到的POD為單體蛋白，這與之前的研究結(jié)果有很大的不同。雙向電泳的結(jié)果顯示了2個(gè)分子量相同而等電點(diǎn)不同的蛋白A和B，說明分離得到的POD實(shí)際上是2個(gè)分子量相同的混合酸性蛋白，由于這2個(gè)蛋白的分子量和理化性質(zhì)十分接近而未能相互分離。 對分離得到的PO

3、D中的一個(gè)組分PODA，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)進(jìn)行肽指紋圖譜分析，未發(fā)現(xiàn)能與之匹配的數(shù)據(jù)。應(yīng)用電噴霧解離-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(ESI-Q-TOF2)解析了PODA的2個(gè)胰酶水解肽段的氨基酸序列，分別是：WFLSGGDWYSLF和VRESAWLDNDADLLAVP，數(shù)據(jù)庫檢索和比對結(jié)果顯示獲得的序列為氨基酸的新序列。多重序列比對結(jié)果表明其中含有一些保守的氨基酸序列。 采用同源克隆

4、的方法，獲得了龍眼果皮POD的保守區(qū)片段，并在此基礎(chǔ)上，通過3'RACE和5'RACE，獲得了龍眼果皮POD全長cDNA序列。該序列與其他植物的PODcDNA有很高的同源性。該cDNA全長1290bp，其中，5'UTR為52bp，3'UTR為238bp，在3'UTR區(qū)域還含有典型的加尾信號AATAA和poly(A)尾。包含一個(gè)996bp的開放閱讀框，編碼332個(gè)氨基酸，在推導(dǎo)的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了活性位點(diǎn)、底物結(jié)合區(qū)、血紅素結(jié)合位點(diǎn)和鈣結(jié)

5、合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域。將串聯(lián)質(zhì)譜測序獲得的2個(gè)肽段序列與其它植物的POD的氨基酸序列比對的結(jié)果顯示：獲得的肽段序列中有部分氨基酸可與開放閱讀框有部分匹配，且這些匹配部分是比較保守的，分別為：E——AD-LA和SGGD——F；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)m/z為1107.49的肽段在的位置在m/z為823.41的肽段的上游，這為克隆分離純化得到的POD提供了可能。 嘗試了龍眼果皮PODcDNA的原核表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為40℃，IPTG濃度為1mM，誘導(dǎo)時(shí)間