高效納米自組裝人工過氧化物酶研究.pdf

1、本文利用半合成酶制備原理，采用內(nèi)部疏水的SDS納米膠團(tuán)結(jié)構(gòu)作為人工過氧化物酶的外部結(jié)構(gòu)；采用分子結(jié)構(gòu)小、適用條件廣且廉價(jià)易得的天然細(xì)胞色素c作為人工過氧化物酶的活性催化中心結(jié)構(gòu)；通過二者在緩沖溶液中發(fā)生自組裝的方式構(gòu)建人工過氧化物酶，來模擬天然過氧化物酶的催化特性。
　　 本工作主要采用光譜學(xué)方法、熱分析方法及電化學(xué)分析方法對(duì)由細(xì)胞色素c和SDS納米膠團(tuán)溶液自組裝構(gòu)建的人工過氧化物酶的催化反應(yīng)能力、結(jié)構(gòu)變化、自組裝過程、酶動(dòng)力學(xué)

2、、自殺性失活底物以及電化學(xué)特性進(jìn)行檢測。
　　 首先，對(duì)人工過氧化物酶的表觀催化活性進(jìn)行測量：采用紫外可見分光光度計(jì)，用過氧化物酶研究工作中最常使用的愈創(chuàng)木酚法測定人工過氧化物酶、細(xì)胞色素c及天然辣根過氧化物酶(HRP)的表觀催化活性，觀察到了人工酶具有良好的催化過氧化氧及愈創(chuàng)木酚發(fā)生氧化反應(yīng)的活性。
　　 第二，研究了人工酶的催化環(huán)境：包括溶液pH值、細(xì)胞色素c濃度、SDS濃度及溶液離子強(qiáng)度在內(nèi)的催化反應(yīng)條件，實(shí)驗(yàn)得出

3、在溶液pH值為10.5時(shí)，人工酶具有較高的表觀活性；且其表觀催化活性與在一定濃度范圍內(nèi)的細(xì)胞色素c(1～10μM)成線性關(guān)系，且最適溶液離子強(qiáng)度隨pH升高而升高；實(shí)驗(yàn)還得出人工過氧化物酶的表觀催化活性隨SDS濃度升高而升高，但是，只要SDS濃度高于其臨界膠束濃度(CMC)人工酶活性與SDS納米膠團(tuán)濃度無關(guān)。
　　 第三，本工作采用紫外可見分光光度法及圓二色譜法對(duì)人工酶中蛋白質(zhì)生色氨基酸殘基：酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸周圍環(huán)境特性的

4、改變以及血紅素周圍環(huán)境的改變做了測試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血紅素周圍環(huán)境疏水性隨pH值增加而加強(qiáng)，這可能導(dǎo)致人工酶活性的增強(qiáng)。二級(jí)結(jié)構(gòu)測試中，β折疊和反向平行結(jié)構(gòu)相較于天然細(xì)胞色素c有所增加，這說明人工酶的活性極大程度上依賴于β折疊結(jié)構(gòu)，β折疊可增加蛋白質(zhì)血紅素周圍的疏水性，而這種結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)具有催化活性；而反向平行結(jié)構(gòu)增加幾乎一倍，說明人工酶結(jié)構(gòu)相較天然細(xì)胞色素c是一個(gè)更具空間對(duì)稱性結(jié)構(gòu)。
　　 第四，采用熱分析法，對(duì)人工酶的結(jié)構(gòu)及

5、自組裝構(gòu)建人工酶這一過程中伴隨的分子間相互作用進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1分子細(xì)胞色素c與116分子SDS相互結(jié)合，改變了SDS納米膠團(tuán)本身結(jié)構(gòu)；表明張力測試表明，構(gòu)建人工酶時(shí)，SDS形成膠團(tuán)的臨界濃度小于5mM，比溶液中只有SDS時(shí)小；并通過DLS法測得人工酶結(jié)構(gòu)的直徑為6.4nm。
　　 第五，對(duì)構(gòu)建的人工過氧化物酶的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，測試得到其具有可觀的催化效率，光譜學(xué)法得到人工酶催化效率與細(xì)胞色素c濃度有關(guān)，其中實(shí)驗(yàn)得最高

6、人工酶催化效率為0.0335μM-1s-1，對(duì)應(yīng)的構(gòu)建人工酶的細(xì)胞色素c濃度為0.1μM；酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值為5.205μM，催化速率常數(shù)為0.174s-1。相當(dāng)于天然HRP催化效率的46％。同時(shí)由于天然HRP具有自殺性失活底物過氧化氫(H2O2)，本文還測試了人工酶及天然HRP的自殺性失活過程，并得出其自殺性失活參數(shù)Ki，數(shù)據(jù)顯示人工酶相對(duì)于天然HRP更耐受高濃度的過氧化氫，有工業(yè)應(yīng)用前景。
　　 第六，本實(shí)驗(yàn)還將細(xì)胞色素c與

7、SDS納米膠團(tuán)自組裝構(gòu)建的人工酶采用納米高分子材料Nafion固定于玻碳電極上，然后通過循環(huán)伏安法研究人工酶在電極上的電化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，人工酶在電極表面能進(jìn)行有效地直接電子轉(zhuǎn)移且為固化機(jī)制，并且通過該電極對(duì)H2O2進(jìn)行檢測，結(jié)果表明固定在電極表面的人工過氧化物酶能夠保持其對(duì)H2O2的生物催化活性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)過氧化氫的檢測，電化學(xué)法測得人工酶的Km為5.28μM，這為研制第三代生物傳感器奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為對(duì)人工酶的研究提供了一種新方法