辣根過氧化物酶的新型包埋及其性能研究.pdf

1、本文闡述了一種酶蛋白質(zhì)分子的新型包埋方法：在酶的包埋過程中，首先，采用了化學(xué)修飾的方法，在酶表面引入不飽和鍵；其次，修飾酶與含雙鍵單體進(jìn)行自由基聚合，對(duì)酶實(shí)施共價(jià)包埋，使得酶與載體形成了多點(diǎn)連接。文中重點(diǎn)討論了包埋酶的制備過程、包埋酶在水溶液中的催化性能以及化學(xué)因素對(duì)其催化活性的影響。
　　 包埋酶制備過程：本文以N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(NAS)為修飾劑，通過其與酶上的氨基反應(yīng)，對(duì)辣根過氧化物酶（HRP）進(jìn)行化學(xué)修飾；然后在修

2、飾酶中加入聚乙二醇400(200)二（甲基）丙烯酸酯和丙烯酰胺作為聚合原料，通過加入自由基引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)，獲得了4種新型包埋的辣根過氧化物酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)HRP與NAS摩爾比約為1：20000，修飾時(shí)間為1h時(shí)，辣根過氧化物酶分子側(cè)鏈修飾結(jié)果最佳；自由基聚合采用最佳原料配比為：辣根過氧化物酶液10ml，丙烯酰胺50mg，單體5g，其中單體分別為聚乙二醇400二丙烯酸酯（單體A）、聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯（單體B）、聚乙二醇2

3、00二丙烯酸酯（單體C）、聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯（單體D）。
　　 本文對(duì)包埋酶在水溶液中的催化性能進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：四種包埋辣根過氧化物酶A-HRP、B-HRP、C-HRP和D-HRP的相對(duì)活性分別為107.8％、47.1%、104.3%和23.3%；在高溫80℃時(shí)，四種包埋酶活性都有所保留，其中A-HRP保留的活性最高為42.1%，而此溫度下游離酶幾乎完全失活；當(dāng)包埋酶C-HRP重復(fù)使用5次后，仍保留62.1%

4、的初始活性；在4℃下儲(chǔ)存30天后，包埋酶A-HRP活性幾乎沒有下降，而游離酶液活性下降了62%，儲(chǔ)存75天后，A-HRP活性仍為原來的55.7%，而游離酶液在儲(chǔ)存50天后出現(xiàn)菌落，蛋白質(zhì)變質(zhì)。
　　 實(shí)驗(yàn)中還考察了化學(xué)因素對(duì)辣根過氧化物酶催化性能的影響。在強(qiáng)酸(pH=3.0)條件下，游離HRP相對(duì)活性低于8%，而包埋酶C-HRP相對(duì)活性為47.9%；在強(qiáng)堿(pH=11.0)條件下，游離HRP相對(duì)活性為13.8%，而C-HRP相對(duì)

5、活性為39.7%；游離酶液最適pH范圍在5.0～7.0，當(dāng)pH＞7時(shí)，其活性急劇下降，而當(dāng)pH＞7時(shí)，包埋酶C-HRP仍然保留較高的活性。在金屬離子溶液中，隨著金屬離子價(jià)態(tài)升高，HRP活性呈下降趨勢。室溫25℃下，用0.5%SDS浸泡30d后，四種包埋酶催化活性仍然有36%以上；用6mol/L脲浸泡30d后，A-HRP催化活性仍有62.7%。在有機(jī)溶劑體系的酶催化反應(yīng)中，隨著有機(jī)溶劑疏水參數(shù)logP的增加，HRP的催化活性增大，當(dāng)采用異