辣根過(guò)氧化物酶的生物印跡及其催化低聚苯胺的合成.pdf

1、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase）是一種從辣根中提取的過(guò)氧化物酶（E，C,1.11.1.7），分子量為44000D的糖蛋白，含糖量為18％。它的分子包含一個(gè)亞鐵血紅素輔基，其卟啉環(huán)是原卟啉，中心離子是Fe（Ⅱ)。由于原料易得，商品價(jià)格低廉，作用底物廣泛，成為過(guò)氧化物酶中使用最廣泛的酶之一。在有機(jī)合成中作為催化劑使用，其催化機(jī)理為過(guò)氧化循環(huán)過(guò)程，對(duì)苯胺及其衍生物，酚類等有很高的催化效率。在酶免疫測(cè)定中，由于HR

2、P 具有發(fā)光底物，因此而建立的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定在臨床中得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，HRP在有機(jī)合成、生物傳感器、食品分析、生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)、熒光分析、污水處理等方面的應(yīng)用更為突出。尤其在免疫診斷試劑術(shù)、生物傳感器、木素降解和工業(yè)“三廢”處理等方面的應(yīng)用研究進(jìn)展飛速。
　　 本課題以辣根過(guò)氧化物酶為研究對(duì)象，以對(duì)苯二胺和過(guò)氧化氫為底物，在25％的二氧六環(huán)溶液中，從酸堿性、溫度、底物濃度等幾個(gè)方面，初步研究了辣根過(guò)氧化物酶催化氧化反應(yīng)的一般特

3、性，測(cè)定了部分酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，同時(shí)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRP 熱穩(wěn)定性較差，酸堿適應(yīng)范圍較窄，有機(jī)相催化效率低，且酶易失活等不良特性。因此，本文以提高有機(jī)相酶催化效率、水相酶熱穩(wěn)定性為出發(fā)點(diǎn)，結(jié)合分子印跡和生物印跡兩種技術(shù)達(dá)到對(duì)辣根過(guò)氧化物酶的印跡。利用底物對(duì)苯二胺誘導(dǎo)酶構(gòu)象，獲得天然印跡酶（NIP），并加入?；噭R來(lái)酸酐制備乙酰化印跡酶（DIP），冷凍干燥后加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑進(jìn)行紫外光聚合，聚合完畢后用二氧六環(huán)洗脫配體，

4、最后干燥就得到了所需的交聯(lián)印跡酶聚合物（CLIPs），即為水相生物印跡酶。
　　 為了考察三種酶（天然印跡酶、乙酰化印跡酶、交聯(lián)印跡酶聚合物）的性質(zhì)，研究?jī)?nèi)容設(shè)計(jì)如下：
　　 （1）考察印跡酶在有機(jī)相中的催化活性，并分別考察pH 值、溫度、水含量、表觀Km 四因素對(duì)印跡酶催化活性的影響。同時(shí)與有機(jī)相游離酶進(jìn)行比較；
　　 （2）考察乙?；≯E酶在水相中的催化活性，并分別考察pH 值、溫度、表觀Km 三因素對(duì)乙?；?/p>

5、印跡酶在水相中的催化活性的影響，同時(shí)與水相游離酶進(jìn)行比較；
　　 （3）考察交聯(lián)印跡酶聚合物在水相中的催化活性，并分別考察pH 值、溫度、表觀Km 三因素對(duì)交聯(lián)印跡酶聚合物在水相中的催化活性的影響，同時(shí)與水相游離酶進(jìn)行比較。結(jié)果表明，三種酶酸堿穩(wěn)定范圍及最適pH 保持不變；印跡后酶活性提高約10倍，表觀Km 值減小約30倍；交聯(lián)后酶熱穩(wěn)定性顯著提高，8 0 ℃時(shí)酶活性仍然很高。但催化效率仍然很低。
　　 由此可見(jiàn)，生物印