自組裝納米簇模擬過氧化物酶-光譜學(xué)及電化學(xué)研究.pdf

1、模擬酶是人工合成或經(jīng)過人工修飾的用來模擬酶的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理以及酶在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過程的超分子結(jié)構(gòu)。與天然酶相比，模擬酶結(jié)構(gòu)簡單、效率高、選擇性好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、反應(yīng)條件范圍廣、價廉易得等優(yōu)點。因此，模擬酶技術(shù)無論是在生物學(xué)、分析化學(xué)等研究領(lǐng)域中還是將來在工業(yè)實際應(yīng)用中都具有重大意義。
　　 本實驗采用高分子帶電材料Nation(NF)和天然馬心細(xì)胞色素C(Cytc)構(gòu)建新型自組裝納米簇過氧化物模擬酶(artificia

2、l peroxidase，AP)結(jié)構(gòu)，采用電子透射技術(shù)、圓二色譜法、紫外可見光等光譜學(xué)方法及直接電化學(xué)方法，研究模擬酶的結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)特性、光譜學(xué)酶促動力學(xué)參數(shù)測量以及模擬酶直接電化學(xué)特性、機制、電化學(xué)酶促動力學(xué)參數(shù)測量等。
　　 實驗選用濃度為0.1μmmol/L的Cytc為模擬酶的“活性中心”，5％的NF溶液為模擬酶外部的“二級結(jié)構(gòu)”，當(dāng)二者混合于Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中，自組裝形成直徑大概為40nm左右的鏈

3、球狀納米簇模擬酶結(jié)構(gòu)。利用紫外分光光度計以H2O2為酶底物，愈創(chuàng)木酚(Guaiacol)為氫供體，測量模擬酶光譜學(xué)特性及酶促動力學(xué)參數(shù)。從實驗數(shù)據(jù)分析得出：當(dāng)模擬酶在pH10.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中時，酶活性最高，但在pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中時模擬酶酶活性穩(wěn)定性最高，所以本實驗選用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液為測試溶液。模擬酶與高濃度底物H2O2共存情況下，模擬酶在

4、堿性環(huán)境中抵抗底物自殺性失活能力最弱，但酶反應(yīng)速度最快，在酸性環(huán)境中，模擬酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高，對高濃度H2O2抵抗能力強。分析外界因素對模擬酶酶活性的影響，實驗選用氨基酸、陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉(SDS)及離子濃度對模擬酶酶活性影響的測試。當(dāng)在模擬酶酶溶液中加入三種氨基酸一組氨酸、賴氨酸、色氨酸(L-His、L-Lys、L-Cys)后，三種氨基酸對模擬酶酶活性均具有影響，在不同酸度條件下，影響各不相同；在模擬酶溶液中加入SDS后，模

5、擬酶酶活性隨SDS濃度的增加而逐漸降低；在不同pH條件下，隨著緩沖液離子濃度的增加對模擬酶酶活性影響各不相同。該模擬酶不僅具有很好的穩(wěn)定性，而且對過氧化氫(H2O2)底物也有很好的響應(yīng)和高催化效率，利用紫外分光光度計測量模擬酶酶促動力學(xué)米氏常數(shù)Km為2.5μmmol/L，催化速率Kcat為0.069s-1，相對催化速率為0.028μM-1s-1，與天然辣根過氧化物酶(HRP)相比，其催化效率為HRP的40％左右。
　　 利用電化

6、學(xué)方法實現(xiàn)了模擬酶的直接電化學(xué)測試，成功將NF-Cytc模擬酶與納米復(fù)合材料納米金(AuNPs)/L-半胱氨酸(L-Cys)/羧基化碳納米管(MWCNTs-COOH-COOH)膜連接并修飾于玻碳電極表面，制備第三代酶生物傳感器，運用電化學(xué)循環(huán)伏安法分析模擬酶電化學(xué)反應(yīng)機制為固化機制，并且電子遷移速度常數(shù)Ks為0.65s-1。模擬酶生物傳感器對底物H2O2具有很好的響應(yīng)，當(dāng)模擬酶催化濃度為0.02至10nmol/L的H2O2，其陰極峰電流