日本血吸蟲(chóng)過(guò)氧化物酶(SjPrxs)的制備及結(jié)晶學(xué)研究.pdf

1、血吸蟲(chóng)?。⊿chistosomiasis）是一種對(duì)人畜健康危害極大的寄生蟲(chóng)病，主要流行于非洲、亞洲和南美洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)。血吸蟲(chóng)病是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在我國(guó)主要流行的是日本血吸蟲(chóng)病(Schistosoma japonicum)?，F(xiàn)在，吡喹酮（Praziquantel）被作為主要的有效化學(xué)治療藥物，單一化療藥物的大量重復(fù)使用有可能導(dǎo)致血吸蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果，已有研究報(bào)道對(duì)吡喹酮產(chǎn)生抗性的曼氏血吸蟲(chóng)（Schistosom

2、a mansoni）蟲(chóng)株。因此，開(kāi)展針對(duì)日本血吸蟲(chóng)藥物靶標(biāo)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能研究對(duì)血吸蟲(chóng)病的防治具有重要意義。
　　日本血吸蟲(chóng)體內(nèi)三種硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（SjPrxs）基因SjPrx1、SjPrx2和SjPrx3，均屬2-Cys類(lèi)型，分別存在于日本血吸蟲(chóng)不同組織部位，執(zhí)行各自的抗氧化生物學(xué)功能。研究結(jié)果表明，SjPrx1在日本血吸蟲(chóng)抵抗過(guò)氧化氫與有機(jī)過(guò)氧化物的損害中扮演了重要的角色，是清除機(jī)體尤其是宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧（ROS

3、）的主要執(zhí)行者，對(duì)于日本血吸蟲(chóng)長(zhǎng)期寄生于宿主體內(nèi)時(shí)抵抗氧化壓力保護(hù)蟲(chóng)體不被消滅發(fā)揮了重要的作用，SjPrx2和SjPrx3也有清除ROS功能。SjPrxs是一類(lèi)潛在的抗血吸蟲(chóng)病藥物靶標(biāo)蛋白。
　　本論文對(duì)日本血吸蟲(chóng)SjPrxs家族蛋白SjPrx1，SjPrx2和SjPrx3進(jìn)行了重組表達(dá)、分離純化和晶體生長(zhǎng)研究，初步解析了SjPrx1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。主要研究結(jié)果包括：
　?。?）N末端帶有6×His Tag的重組表達(dá)質(zhì)粒sy

4、nSjPrx1-pET28a和wtSjPrx1-pET28a在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，獲得胞內(nèi)表達(dá)的可溶性蛋白，分子量大小約為25 kD。表達(dá)條件為OD600為1.0時(shí)加入終濃度為0.8 mM的IPTG，低溫（24℃）誘導(dǎo)18 h，獲得較高的表達(dá)量。目的蛋白經(jīng)Ni2+柱和DEAE柱純化，純度高于95％，蛋白酶活實(shí)驗(yàn)表明synSjPrx1有活性。synSjPrx1蛋白濃縮至42 mg/mL，在0.2 M NH4Cl，0.

5、2 M Tris-HCl，pH7.5，0.025 M CaCl2條件獲得分辨率達(dá)3.05?的單晶，晶體結(jié)構(gòu)表明在一個(gè)非對(duì)稱(chēng)單元中有三個(gè)分子，分子的C末端18個(gè)氨基酸殘基電子云未見(jiàn)。
　　（2）克隆C末端帶有6×His Tag的wtSjPrx1-pET42a，將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒wtSjPrx1-pET42a在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)，獲得胞內(nèi)表達(dá)的可溶性蛋白。經(jīng)Ni2+柱和DEAE柱純化，純度高于95%，濃縮至45 mg/

6、mL（wtSjPrx1），在試劑盒初步篩選下，在1.0 M Ammonium sulfate，0.1 M HEPES pH7.0，0.5%Polyethylene glycol8000和0.1 M Sodium malonate pH7.0，12%Polyethylene glycol3350條件下能夠生長(zhǎng)出有比較規(guī)則菱形晶體和有一定厚度的多邊形晶體。
　　（3）克隆wtSjPrx2-pET28a和wtSjPrx3-pET28a重