甘薯葉過氧化物酶的分離純化、部分性質(zhì)及固定化研究.pdf

1、過氧化物酶(Peroxidase，POD，EC1.11.1.7)是廣泛存在于各種生物體內(nèi)的一類氧化還原酶，催化由過氧化氫參與的多種還原劑的氧化反應(yīng)，屬于含血紅素的氧化酶。過氧化物酶可以用作檢測試劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、工業(yè)等領(lǐng)域的檢測，還可以用于治理環(huán)境污染等。
　　 本研究以新鮮甘薯葉為原料，經(jīng)過組織搗碎、緩沖液浸提、硫酸銨分級沉淀、超濾和DEAE-Sepharose離子交換層析以及Sephacryl S-200HR凝膠過濾

2、層析等步驟，得到了電泳純的甘薯葉POD。該酶比活力為91923.14U/mg，純化倍數(shù)為255.69，回收率為1.59％。經(jīng)過SDS-PAGE以及Sephacryl S-200HR凝膠過濾層析，測得該POD的相對分子質(zhì)量約為35kD。
　　 用過氧化氫及愈創(chuàng)木酚作底物測定酶活，發(fā)現(xiàn)該酶的最適pH值為5.6，最適溫度為60℃。該酶在20～50℃、pH4～8內(nèi)穩(wěn)定。以不同濃度H202為底物在pH7.2和25℃下測得該酶Km值為0.2

3、91mol/L。低濃度草酸、尿素、Li+、Na+、K+、Mg2+等對該酶有激活作用；SDS、KSCN、抗壞血酸(AsA)、Mn2+等對該酶有抑制作用；有機溶劑甲醇、乙醇、乙二醇、異丙醇對POD均有一定抑制作用，其抑制作用強弱順序為異丙醇＞乙醇＞甲醇＞乙二醇。
　　 用化學(xué)修飾劑對該酶的功能基團進行修飾，發(fā)現(xiàn)巰基以及二硫鍵可能是其活性中心的必需基團，而精氨酸殘基、甲硫氨酸硫醚基、組氨酸殘基、賴氨酸殘基、絲氨酸殘基、酪氨酸酚羥基可能

4、不是該酶活性中心的必需基團。
　　 采用聚乙烯醇-海藻酸鈉為載體、飽和硼酸作交聯(lián)劑、CaCl2作固定劑對酶進行固定化，經(jīng)過單因素實驗探究了海藻酸鈉濃度、加酶量、CaCl2濃度和固定化時間對固定化的影響，再通過正交優(yōu)化實驗探究了這幾個因素對固定化影響的大小以及各因素的最佳水平組合。四個因素的最佳水平分別為0.2％PVA-3％CA、載體與酶液比例為3：1、飽和硼酸-4％CaCl2、固定化時間15min。用上述四因素的最佳水平組合固定