一種具有酪氨酸交聯(lián)活性的小麥種子過氧化物酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、小麥的加工品質(zhì)與小麥中各種蛋白含量和組成密切相關(guān)。小麥高分子量麥谷蛋白(HMW-GS)、低分子量麥谷蛋白(LMW-GS)和醇溶蛋白(gliadins)交聯(lián)形成了面筋三維蛋白網(wǎng)絡(luò)骨架，它直接決定了小麥的加工品質(zhì)。闡明面筋蛋白的交聯(lián)機(jī)制對小麥加工品質(zhì)改良有重要意義。2001年，Tilley等人<'30>提出了面筋酪氨酸交聯(lián)理論，該理論對經(jīng)典的面筋蛋白二硫鍵交聯(lián)假說提出了挑戰(zhàn)。研究結(jié)果顯示，酪氨酸交聯(lián)的形成許多都是由過氧化物酶或具有過氧化物酶

2、性質(zhì)的酶所催化的。本研究從小麥種子中分離純化出一種小麥過氧化物酶(WsPOD)，對WsPOD的理化性質(zhì)、光譜特性進(jìn)行了研究；通過生物質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF)對WsPOD肽指紋圖譜作了初步分析；酪氨酸催化實(shí)驗(yàn)表明WsPOD具有酪氨酸交聯(lián)活性；WsPOD的微量摻粉實(shí)驗(yàn)表明WsPOD能提高面團(tuán)的流變學(xué)特性。本研究旨在闡明面筋蛋白酪氨酸交聯(lián)的催化機(jī)理，支持和完善面筋交聯(lián)的新理論，以期建立小麥品質(zhì)改良的新策略，為食品工業(yè)大量使用的化學(xué)添加劑

3、找到安全的替代品。 1.WsPOD的分離純化。關(guān)于過氧化物酶的分離純化已有較多報道，但小麥中過氧化物酶分離純化的報道很少，國內(nèi)尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)建立了從小麥種子中分離過氧化物酶WsPOD的高效簡捷的分離方法；經(jīng)乙酸酸沉淀、硫酸銨分級沉淀、FPLC-Sotlrce 30S離子交換柱層析，F(xiàn)PLC-Superdex G-75凝膠過濾柱層析從小麥種子中分離得到了電泳純的WsPOD。SDS-PAGE結(jié)果顯示為單一條帶；SDS-PAGI

4、E顯示表觀分子量約為36KD左右。 2.WsPOD的理化性質(zhì)。以愈創(chuàng)木酚為底物，對WsPOD催化反應(yīng)最適pH值、最適過氧化氫濃度、最適溫度、熱穩(wěn)定性；光譜特性等理化性質(zhì)進(jìn)行了測定，結(jié)果表明WsPOD催化反應(yīng)最適pH值在5.0左右，最適反應(yīng)溫度為40℃，最適過氧化氫濃度為14mmol/L,紫外可見光譜掃描分析顯示該酶為含血紅素輔基的酸性蛋白，在399nm處有一典型的Soret蒂吸收；熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明WsPOD具有較好的耐熱性。

5、 3.WsPOD肽指紋圖譜分析。分離得到的WsPOD應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進(jìn)行肽指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中僅有一個結(jié)果與WsPOD肽指紋相匹配。對獲得數(shù)據(jù)信息進(jìn)行分析顯示W(wǎng)sPOD為胚乳特異性表達(dá)的一種過氧化酶，保守性分析表明該酶具有兩個保守性區(qū)域分別為過氧化物酶催化活性位點(diǎn)和血紅素輔基近端結(jié)合位點(diǎn)。WsPOD的肽質(zhì)量指紋數(shù)據(jù)得到的序列信息，為WsPOD的cDNA克隆奠定

6、了良好的基礎(chǔ)。 4.WsPOD的酪氨酸交聯(lián)活性測定。將WsPOD催化單體酪氨酸反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)UV1100型紫外可見分光光度計掃描分析和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-ESI/MS)分析，結(jié)果顯示W(wǎng)sPOD能催化單體酪氨酸形成雙體酪氨酸，具有酪氨酸交聯(lián)活性。 5．WsPOD的微量摻粉實(shí)驗(yàn)。以洛陽8716作為參比基礎(chǔ)面粉，采用50克面粉體系參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14614-93方法進(jìn)行微量摻粉實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明WsPOD能