中國綠水?？箟难猁}過氧化物酶基因的克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá).pdf

1、單細(xì)胞真核綠藻在中國綠水螅（Hydra sinensis）體內(nèi)共生是發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域有較高科研價(jià)值的特殊生物學(xué)現(xiàn)象。我們?cè)趯?duì)綠水螅宿主與共生藻相互關(guān)系的前期研究中發(fā)現(xiàn)，去除共生藻的綠水螅仍能長期存活和繁殖，離體共生藻卻失去自由存活能力。這種非對(duì)稱依賴型共生關(guān)系的機(jī)理值得深入研究，而水螅與共生藻間的識(shí)別特異性、相容、協(xié)同、互作、代謝流和基因流等共生策略是其中的重要科學(xué)問題。本課題組在進(jìn)行中國綠水螅轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了綠水螅的抗壞

2、血酸鹽過氧化物酶基因EST片段，而該酶是一種植物性的過氧化物酶。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期開展的中國綠水螅轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)獲得的抗壞血酸鹽過氧化物酶基因（ascorbate peroxidase,APX）的EST數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)2條特異性引物，特異性引物分別與試劑盒接頭引物配對(duì)進(jìn)行5’RACE和3’RACE。再根據(jù)5’RACE和3’RACE PCR產(chǎn)物測序結(jié)果設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增中國綠水螅APX基因編碼區(qū)全長序列的上、下游特異性引物，

3、以中國綠水螅SMART RACE cDNA文庫為模板擴(kuò)增了其APX基因編碼區(qū)全長序列。PCR產(chǎn)物純化后與克隆載體pMD-18T連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109菌株。運(yùn)用菌落PCR方法鑒定陽性克隆后進(jìn)行DNA測序(重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-HSAPX)，測序結(jié)果表明中國綠水螅APX基因編碼區(qū)全長序列為1104個(gè)核苷酸，編碼367個(gè)氨基酸?；贏PX氨基酸序列數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析表明中國綠水螅APX蛋白與植物APX蛋白同源、而與動(dòng)物性的

4、過氧化物酶沒有關(guān)聯(lián)。中國綠水螅APX基因cDNA序列的成功克隆為深入探討水螅APX基因的來源及水螅APX蛋白的生理功能奠定了基礎(chǔ)。⑵以已制備的pMD18-T-HSAPX重組質(zhì)粒為模板、采用重疊延伸PCR（PCR）方法對(duì)中國綠水螅APX基因的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，再基于原核表達(dá)質(zhì)粒pET-GST多酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)分子克隆方法把中國綠水螅APX基因編碼區(qū)全長序列連接到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-GST上，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-GST-H