草菇漆酶與過氧化物酶生物信息學分析及表達研究.pdf

1、草菇是一種生長在熱帶和亞熱帶地區(qū)深受歡迎的可栽培食用菌,它可以以木質纖維素含量豐富的農業(yè)廢棄物為生長基質,能夠產生多種復合酶,將生長基質降解為可以滿足生長需要的葡萄糖等能源物質。本研究借助于草菇 V23菌株全基因組測序的基礎上,運用生物信息學方法對草菇基因組中木質素降解相關的同源基因進行了分析,獲得了推定的草菇漆酶、錳過氧化物酶的編碼基因序列。在此基礎上,本研究進一步對漆酶的表達誘導條件、不同生長時期的表達量,以及錳過氧化物酶的表達情況

2、進行了研究。本研究的主要結果如下:
　　1、草菇基因組中存在11個漆酶基因,根據(jù)漆酶基因在基因組中的位置依次命名為lac1-lac11。lac1-lac10成簇排列在scaffold6中,lac11在scaffold8上。根據(jù)草菇漆酶基因的內含子相對位置與氨基酸序列的保守性,分析了草菇漆酶基因系統(tǒng)發(fā)育關系。草菇漆酶基因分為2個亞族,其中 lac1-lac5,lac7-lac10為一類, lac6與lac11為另一類。草菇漆酶氨基酸

3、序列的長度、相對分子質量和理論等電點與典型的真菌漆酶類似。Signal P4.0預測的結果顯示除了lac8與lac10外,其他漆酶都具有信號肽序列,推測這些漆酶可能分泌到胞外。
　　2、草菇漆酶基因的5端上游2000bp左右區(qū)域中存在多個潛在的順式作用元件序列位點,包括TATAbox、CAATbox、GCbox、MRE、XRE、CreA結合位點和氮因子調控位點等。根據(jù)這些位點推測草菇漆酶的活性易受到培養(yǎng)基中的氮源、碳源、金屬離子和

4、芳香族化合物的影響。利用搖瓶培養(yǎng)方法探究了不同濃度的銅離子、錳離子與2,5-二甲基苯胺分別對草菇漆酶活力的影響。實驗結果顯示:當銅離子含量為200μM或錳離子含量為100μM或2,5-xy含量為80μM時,草菇漆酶的活性最高。
　　3、實時熒光定量PCR檢測了200μM銅離子、100μM錳離子、80μM2,5-xy分別對草菇漆酶轉錄情況的影響,結果顯示:培養(yǎng)基中添加200μM Cu離子時漆酶基因lac1、lac4、lac5、lac

5、8、lac9與lac10表達量高于添加1.6μM Cu離子;培養(yǎng)基中添加80μM2,5-xy+1.6μM Cu時,漆酶基因lac8、lac9與lac10表達量高于僅添加1.6μM Cu離子;培養(yǎng)基中添加100μM Mn+1.6 Cu離子時,漆酶基因lac6與lac10表達量高于僅添加1.6μM Cu離子。培養(yǎng)基中添加200μM Cu能夠提高大多數(shù)草菇漆酶基因的轉錄水平。
　　4、RT-PCR檢測了草菇原基期、紐扣期、蛋形期、伸長期

6、與成熟期的漆酶表達情況,結果表明草菇11個漆酶基因全部能夠發(fā)生轉錄,但是表達量在不同時期有不同的改變。lac1、lac5、lac7和lac8表達量從針頭期開始逐漸降低。lac3、lac6和lac11在針頭期具有較低的表達,紐扣期表達量增高,在蛋形期達到最高峰,伸長期表達量有明顯下降,lac3成熟期表達量提高,lac6成熟期表達量維持穩(wěn)定。lac2、lac4、lac9和lac10在紐扣期最高,伸長期表達降低,而lac9與lac10成熟期又

7、有了明顯的提高。推測草菇漆酶基因在草菇子實體形成過程中起重要作用。
　　5、本研究在草菇全基因組中發(fā)現(xiàn)了4個擔子菌錳過氧化物酶 MnP基因同源物(vv-mnp1、vv-mnp2、vv-mnp3和vv-mnp4),vv-mnp1與vv-mnp2基因結構相同, vv-mnp3與vv-mnp4基因結構相似。在4個草菇MnP基因啟動子區(qū)域存在AP-2、cAMP、MRE、XRE和HSE等調控元件,預示著草菇中MnP基因的轉錄可能會受到氮源、

8、碳源、重金屬離子、芳香族化合物以及熱擊的影響。草菇MnP具有信號肽,不存在跨膜區(qū)域,表明其可能是分泌蛋白。草菇MnP中形成4個二硫鍵的8個半胱氨酸、潛在的錳離子和鈣離子結合位點,在擔子菌MnP中高度保守。系統(tǒng)進化樹分析顯示草菇MnP1和MnP2與香菇MnP1親緣關系最近,而MnP3和MnP4與灰蓋鬼傘過氧化物酶有較近的親緣關系。RT-PCR檢測到 vv-mnp1、vv-mnp3與vv-mnp4能在含錳離子的培養(yǎng)基中表達,但運用錳離子氧化