草菇漆酶與過氧化物酶生物信息學(xué)分析及表達(dá)研究.pdf

1、草菇是一種生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)深受歡迎的可栽培食用菌,它可以以木質(zhì)纖維素含量豐富的農(nóng)業(yè)廢棄物為生長(zhǎng)基質(zhì),能夠產(chǎn)生多種復(fù)合酶,將生長(zhǎng)基質(zhì)降解為可以滿足生長(zhǎng)需要的葡萄糖等能源物質(zhì)。本研究借助于草菇 V23菌株全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上,運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)草菇基因組中木質(zhì)素降解相關(guān)的同源基因進(jìn)行了分析,獲得了推定的草菇漆酶、錳過氧化物酶的編碼基因序列。在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步對(duì)漆酶的表達(dá)誘導(dǎo)條件、不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量,以及錳過氧化物酶的表達(dá)情況

2、進(jìn)行了研究。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1、草菇基因組中存在11個(gè)漆酶基因,根據(jù)漆酶基因在基因組中的位置依次命名為lac1-lac11。lac1-lac10成簇排列在scaffold6中,lac11在scaffold8上。根據(jù)草菇漆酶基因的內(nèi)含子相對(duì)位置與氨基酸序列的保守性,分析了草菇漆酶基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。草菇漆酶基因分為2個(gè)亞族,其中 lac1-lac5,lac7-lac10為一類, lac6與lac11為另一類。草菇漆酶氨基酸

3、序列的長(zhǎng)度、相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)與典型的真菌漆酶類似。Signal P4.0預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示除了lac8與lac10外,其他漆酶都具有信號(hào)肽序列,推測(cè)這些漆酶可能分泌到胞外。
　　2、草菇漆酶基因的5端上游2000bp左右區(qū)域中存在多個(gè)潛在的順式作用元件序列位點(diǎn),包括TATAbox、CAATbox、GCbox、MRE、XRE、CreA結(jié)合位點(diǎn)和氮因子調(diào)控位點(diǎn)等。根據(jù)這些位點(diǎn)推測(cè)草菇漆酶的活性易受到培養(yǎng)基中的氮源、碳源、金屬離子和

4、芳香族化合物的影響。利用搖瓶培養(yǎng)方法探究了不同濃度的銅離子、錳離子與2,5-二甲基苯胺分別對(duì)草菇漆酶活力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:當(dāng)銅離子含量為200μM或錳離子含量為100μM或2,5-xy含量為80μM時(shí),草菇漆酶的活性最高。
　　3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了200μM銅離子、100μM錳離子、80μM2,5-xy分別對(duì)草菇漆酶轉(zhuǎn)錄情況的影響,結(jié)果顯示:培養(yǎng)基中添加200μM Cu離子時(shí)漆酶基因lac1、lac4、lac5、lac

5、8、lac9與lac10表達(dá)量高于添加1.6μM Cu離子;培養(yǎng)基中添加80μM2,5-xy+1.6μM Cu時(shí),漆酶基因lac8、lac9與lac10表達(dá)量高于僅添加1.6μM Cu離子;培養(yǎng)基中添加100μM Mn+1.6 Cu離子時(shí),漆酶基因lac6與lac10表達(dá)量高于僅添加1.6μM Cu離子。培養(yǎng)基中添加200μM Cu能夠提高大多數(shù)草菇漆酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　4、RT-PCR檢測(cè)了草菇原基期、紐扣期、蛋形期、伸長(zhǎng)期

6、與成熟期的漆酶表達(dá)情況,結(jié)果表明草菇11個(gè)漆酶基因全部能夠發(fā)生轉(zhuǎn)錄,但是表達(dá)量在不同時(shí)期有不同的改變。lac1、lac5、lac7和lac8表達(dá)量從針頭期開始逐漸降低。lac3、lac6和lac11在針頭期具有較低的表達(dá),紐扣期表達(dá)量增高,在蛋形期達(dá)到最高峰,伸長(zhǎng)期表達(dá)量有明顯下降,lac3成熟期表達(dá)量提高,lac6成熟期表達(dá)量維持穩(wěn)定。lac2、lac4、lac9和lac10在紐扣期最高,伸長(zhǎng)期表達(dá)降低,而lac9與lac10成熟期又

7、有了明顯的提高。推測(cè)草菇漆酶基因在草菇子實(shí)體形成過程中起重要作用。
　　5、本研究在草菇全基因組中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)擔(dān)子菌錳過氧化物酶 MnP基因同源物(vv-mnp1、vv-mnp2、vv-mnp3和vv-mnp4),vv-mnp1與vv-mnp2基因結(jié)構(gòu)相同, vv-mnp3與vv-mnp4基因結(jié)構(gòu)相似。在4個(gè)草菇MnP基因啟動(dòng)子區(qū)域存在AP-2、cAMP、MRE、XRE和HSE等調(diào)控元件,預(yù)示著草菇中MnP基因的轉(zhuǎn)錄可能會(huì)受到氮源、

8、碳源、重金屬離子、芳香族化合物以及熱擊的影響。草菇MnP具有信號(hào)肽,不存在跨膜區(qū)域,表明其可能是分泌蛋白。草菇MnP中形成4個(gè)二硫鍵的8個(gè)半胱氨酸、潛在的錳離子和鈣離子結(jié)合位點(diǎn),在擔(dān)子菌MnP中高度保守。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示草菇MnP1和MnP2與香菇MnP1親緣關(guān)系最近,而MnP3和MnP4與灰蓋鬼傘過氧化物酶有較近的親緣關(guān)系。RT-PCR檢測(cè)到 vv-mnp1、vv-mnp3與vv-mnp4能在含錳離子的培養(yǎng)基中表達(dá),但運(yùn)用錳離子氧化