小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系建立和優(yōu)化及抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因(Ta-APX)轉(zhuǎn)化小麥研究.pdf

1、為了建立和優(yōu)化Alondra’s的高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，為小麥遺傳轉(zhuǎn)化提供更多的受體基因型。本研究以Alondra’s的幼胚為外植體，研究了培養(yǎng)基種類、不同激素等對(duì)其幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)及其再生的影響。結(jié)果表明，在使用N6培養(yǎng)基時(shí)，添加3 mg.L-1的2,4-D并附加1000 mg.L-1的CH對(duì)其愈傷的誘導(dǎo)效果較好；添加4mg.L－1的ZT、不附加IAA對(duì)其分化效果最好。通過(guò)構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220.6，利用基

2、因槍法將Hyg基因?qū)氲紸londra’s幼胚愈傷組織，以探索Alondra’s的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。最終在含100 mg.L-1潮霉素選擇培養(yǎng)基上篩選、分化，獲得了30株抗性植株，經(jīng)PCR檢測(cè)，其中5株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為0.5％。Alondra’s遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立豐富了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的基因型，為小麥品種的轉(zhuǎn)基因改良和在不同背景中研究基因的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化具有外源基因表達(dá)穩(wěn)定、一般為單拷貝等

3、優(yōu)點(diǎn)，遺傳轉(zhuǎn)化效率低、體系不穩(wěn)定限制了該轉(zhuǎn)化方法在小麥中的廣泛應(yīng)用。為了優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化條件，本研究以普通小麥品種揚(yáng)麥15和Alondra’s的幼胚產(chǎn)生的愈傷組織為受體材料，通過(guò)檢測(cè)Gus基因的瞬時(shí)表達(dá)情況，比較了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的主要影響因子的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明，在相同條件下兩個(gè)品種農(nóng)桿菌侵染的最佳條件不盡相同。揚(yáng)麥15的最佳優(yōu)化條件為：先在不添加AS的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，然后在菌液濃度為OD600=1.0、AS濃度為100μmol

4、/L條件下侵染10min，最后在25℃共培養(yǎng)1d;Alondra’s則在菌液濃度為OD600=0.5、共培養(yǎng)時(shí)間為2d時(shí)，表現(xiàn)出最佳的Gus基因瞬時(shí)表達(dá)率。
　　 植物在逆境脅迫及病原菌侵染下，體內(nèi)活性氧會(huì)大量積累，從而破壞正常新陳代謝時(shí)清除平衡，活性氧的清除系統(tǒng)對(duì)于維持植物的正常生理功能及正常的新陳代謝具有重要的意義。因此，通過(guò)植物基因工程的方法，將能夠清除植物體內(nèi)活性氧類物質(zhì)的過(guò)氧化物酶基因?qū)氲骄C合性狀優(yōu)良的小麥品種中，對(duì)

5、于提高小麥的抗氧化脅迫能力有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室在揚(yáng)麥5號(hào)及與其回交7代的小麥/簇毛麥6VS/6AL易位系為材料建立的白粉菌誘導(dǎo)的葉片SSH文庫(kù)中，克隆了一個(gè)小麥抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因（Ta-APX），并發(fā)現(xiàn)該基因在白粉菌侵染初期發(fā)揮一定作用。為了進(jìn)一步研究該基因在抗白粉病中的功能及其作用機(jī)制，研究其抗氧化能力與白粉菌侵染應(yīng)答的關(guān)系。本研究在構(gòu)建植物表達(dá)載體pAHC-Ta-APX的基礎(chǔ)上，利用基因槍法將其導(dǎo)入到小麥品種揚(yáng)麥158的幼胚

6、愈傷組織。在含除草劑的培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)篩選和分化，最終獲得38株抗性再生植株。根據(jù)bar基因、ubi啟動(dòng)子及目的基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)38株再生植株進(jìn)行PCR鑒定，最終共獲得10株含目的基因的陽(yáng)性植株。為了研究轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化脅迫性，分析了PEG6000誘導(dǎo)及白粉菌脅迫下T1代轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)APX酶活性，結(jié)果表明，在兩種脅迫誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)基因株系的APX酶活性均高于對(duì)照植株。在大田條件下對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗白粉病和赤霉病接種鑒定，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基