小麥遺傳轉化體系建立和優(yōu)化及抗壞血酸過氧化物酶基因(Ta-APX)轉化小麥研究.pdf

1、為了建立和優(yōu)化Alondra’s的高效再生及遺傳轉化體系，為小麥遺傳轉化提供更多的受體基因型。本研究以Alondra’s的幼胚為外植體，研究了培養(yǎng)基種類、不同激素等對其幼胚愈傷組織的誘導及其再生的影響。結果表明，在使用N6培養(yǎng)基時，添加3 mg.L-1的2,4-D并附加1000 mg.L-1的CH對其愈傷的誘導效果較好；添加4mg.L－1的ZT、不附加IAA對其分化效果最好。通過構建植物表達載體pCAMBIA1301-220.6，利用基

2、因槍法將Hyg基因導入到Alondra’s幼胚愈傷組織，以探索Alondra’s的高效遺傳轉化體系。最終在含100 mg.L-1潮霉素選擇培養(yǎng)基上篩選、分化，獲得了30株抗性植株，經PCR檢測，其中5株為陽性轉基因植株，轉化率為0.5％。Alondra’s遺傳轉化體系的建立豐富了小麥遺傳轉化的基因型，為小麥品種的轉基因改良和在不同背景中研究基因的功能奠定了良好的基礎。
　　 農桿菌介導遺傳轉化具有外源基因表達穩(wěn)定、一般為單拷貝等

3、優(yōu)點，遺傳轉化效率低、體系不穩(wěn)定限制了該轉化方法在小麥中的廣泛應用。為了優(yōu)化農桿菌介導的小麥遺傳轉化條件，本研究以普通小麥品種揚麥15和Alondra’s的幼胚產生的愈傷組織為受體材料，通過檢測Gus基因的瞬時表達情況，比較了農桿菌介導的主要影響因子的轉化效率。結果表明，在相同條件下兩個品種農桿菌侵染的最佳條件不盡相同。揚麥15的最佳優(yōu)化條件為：先在不添加AS的培養(yǎng)基中預培養(yǎng)，然后在菌液濃度為OD600=1.0、AS濃度為100μmol

4、/L條件下侵染10min，最后在25℃共培養(yǎng)1d;Alondra’s則在菌液濃度為OD600=0.5、共培養(yǎng)時間為2d時，表現出最佳的Gus基因瞬時表達率。
　　 植物在逆境脅迫及病原菌侵染下，體內活性氧會大量積累，從而破壞正常新陳代謝時清除平衡，活性氧的清除系統(tǒng)對于維持植物的正常生理功能及正常的新陳代謝具有重要的意義。因此，通過植物基因工程的方法，將能夠清除植物體內活性氧類物質的過氧化物酶基因導入到綜合性狀優(yōu)良的小麥品種中，對

5、于提高小麥的抗氧化脅迫能力有著重要的意義。本實驗室在揚麥5號及與其回交7代的小麥/簇毛麥6VS/6AL易位系為材料建立的白粉菌誘導的葉片SSH文庫中，克隆了一個小麥抗壞血酸過氧化物酶基因（Ta-APX），并發(fā)現該基因在白粉菌侵染初期發(fā)揮一定作用。為了進一步研究該基因在抗白粉病中的功能及其作用機制，研究其抗氧化能力與白粉菌侵染應答的關系。本研究在構建植物表達載體pAHC-Ta-APX的基礎上，利用基因槍法將其導入到小麥品種揚麥158的幼胚

6、愈傷組織。在含除草劑的培養(yǎng)基上經過篩選和分化，最終獲得38株抗性再生植株。根據bar基因、ubi啟動子及目的基因序列設計引物，對38株再生植株進行PCR鑒定，最終共獲得10株含目的基因的陽性植株。為了研究轉基因植株的抗氧化脅迫性，分析了PEG6000誘導及白粉菌脅迫下T1代轉基因植株內APX酶活性，結果表明，在兩種脅迫誘導下轉基因株系的APX酶活性均高于對照植株。在大田條件下對T1代轉基因植株進行抗白粉病和赤霉病接種鑒定，結果表明，轉基