脂氫過氧化物裂解酶的克隆表達、酶學性質(zhì)及固定化研究.pdf

1、脂氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,HPL)是一種膜結(jié)合血紅素蛋白,催化脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)的反應(yīng)產(chǎn)物——脂氫過氧化物(不飽和脂肪酸如亞麻酸、亞油酸的氫過氧化物)裂解生成短鏈揮發(fā)性醛和含氧酸。HPL的催化產(chǎn)物己醛、己烯醛及其醛醇是水果、蔬菜和綠葉特征風味的重要組成成分,作為添加劑,廣泛的應(yīng)用在化妝品工業(yè)和食品工業(yè)中；在食品工業(yè)中,主要用于果蔬加工及儲藏過程中的“回鮮”,增加果蔬的商業(yè)價值

2、。
　　 根據(jù)NCBI中已登錄的馬鈴薯HPL基因設(shè)計RT-PCR所需引物。使用Trizol試劑提取馬鈴薯幼葉中的總RNA,并以此為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈；以該鏈為模板,PCR擴增獲得目的基因并連接到pMD19-T簡易載體。測序結(jié)果顯示,所獲得的馬鈴薯HPL cDNA全長1,443 bp,編碼480個氨基酸,編碼產(chǎn)物的理論分子量為53.9 kDa。該基因序列已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫,登錄號為GQ281583。
　　

3、 將該基因插入到表達載體pQE-30中,并轉(zhuǎn)化到宿主細胞E.coli M15中,成功誘導表達出融合了N端His-tag的脂氫過氧化物裂解酶；對重組HPL采用親和層析法一步分離純化至電泳純,分子量約為54 kDa,與理論分子量一致。相比13-亞油酸氫過氧化物(13-HPOD),馬鈴薯HPL更易催化13-亞麻酸氫過氧化物(13-HPOT),相應(yīng)的揮發(fā)性產(chǎn)物經(jīng)頂空氣相色譜鑒定為正己醛和2-E-己烯醛。重組馬鈴薯HPL的最適作用pH和溫度分別

4、為6.5和25℃；該酶具有較寬的作用pH范圍,但對熱敏感,高溫(40℃以上)下保溫易失活；重組馬鈴薯HPL對13-HPOT、13-HPOD的Km分別為56.6、71.7μM。表面活性劑Triton X-100能夠顯著提高該酶的酶活,氯化鈉、氯化鉀同樣能提高酶活,而氯化鈣、氯化鎂不能提高該酶的酶活,氯化鈣甚至會降低酶活。
　　 采用海藻酸鈉明膠協(xié)同包埋、同時使用戊二醛交聯(lián)制備固定化莧菜脂氫過氧化物裂解酶,考察了海藻酸鈉、明膠濃度、