醛糖還原酶（AR）參與PDGF-BB促系膜細(xì)胞增殖作用的機(jī)制研究.pdf

1、腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell，MsC)增生是多種腎小球腎炎常見(jiàn)的共同病理改變。MsC增生常伴有細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的增多。腎小球系膜細(xì)胞增殖和ECM的過(guò)度積聚是腎小球硬化的重要病理改變，并且是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要原因之一。醛糖還原酶(aldose reductase，AR)屬于NADPH依賴(lài)型醛一酮還原酶家族，是多元醇通路的限速酶。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外大量研究證明，AR參與了多種類(lèi)型細(xì)胞

2、的增生與凋亡活動(dòng)的調(diào)節(jié)。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AR的大鼠MsC生長(zhǎng)周期明顯加快，若以醛糖還原酶抑制劑(aldose reductase inhibitor，ARI)孵育，則能明顯抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)；此外，ARI還能部分抑制血小板源性生長(zhǎng)因子--BB(platelet-derived growth factor，PDGF-BB)促大鼠系膜細(xì)胞的增殖作用。本課題在此基礎(chǔ)上將進(jìn)一步探討AR影響PDGF--BB促大鼠MsC增殖的作用機(jī)制。

3、 第一部分信號(hào)通路對(duì)PDGF--BB促大鼠系膜細(xì)胞增殖的影響 目的 通過(guò)比較相關(guān)信號(hào)通路(ERK，JNK，p38及P13K)抑制劑對(duì)PDGF促大鼠MsC增殖的影響，來(lái)驗(yàn)證MAPK和P13K等信號(hào)通路參與PDGF--BB促系膜細(xì)胞增殖作用的機(jī)制。 方法 原代分離、培養(yǎng)大鼠MsC，接種于96孔板，觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，以MTT法(3-[4，5-dimethylthiazol-2-y1]-2，5-dip

4、henyltetrazolium bromide，四哇藍(lán)比色法)測(cè)12及24小時(shí)的細(xì)胞A490值。流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,FCM)觀察各組細(xì)胞12及24小時(shí)的生長(zhǎng)周期變化情況。 結(jié)果 PDGF-BB刺激MsC可促進(jìn)細(xì)胞顯著增生，且與對(duì)照組相比其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。若以ERK(U0126)、JNK(SP600125)及P13K抑制劑[J(LY294002)預(yù)孵育培養(yǎng)細(xì)胞45min后再以

5、PDGF--BB刺激12及24小時(shí)，其A490值明顯低于單純PDGF刺激組，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而p38抑制劑(SB203580)對(duì)PDGF的促增殖作用沒(méi)有明顯影響(P>0.05)。FCM結(jié)果與MTT結(jié)果一致。 結(jié)論 ERK、JNK及P13K抑制劑可以抑制PDGF-BB促大鼠MsC增殖作用，而后者不能被p38抑制劑所抑制。提示PDGF的促增殖作用可能與ERK、JNK及P13K信號(hào)通路有關(guān)，與p38信

6、號(hào)通路可能無(wú)關(guān)。 第二部分 ARI對(duì)PDGF-BB促M(fèi)sC增殖過(guò)程中信號(hào)通路活化的影響 目的 通過(guò)觀察ARI對(duì)大鼠MsC表達(dá)PDGF-B鏈的影響，探討AR是否影響MsC合成內(nèi)源性PDGF的過(guò)程。檢測(cè)ARI對(duì)PDGF所致的MAPK(ERK、JNK及p38三條信號(hào)通路)和P13K/Akt信號(hào)通路活化的影響，探討其作用機(jī)制。 方法 以半定量RT-PCR方法從轉(zhuǎn)錄水平觀察ARI對(duì)MsC合成PDGF-B鏈的

7、影響。以Western blot免疫印跡法觀察ARI對(duì)PDGF所致的MAPK(ERK、JNK及p38三條信號(hào)通路)和P13K/Akt信號(hào)通路磷酸化的改變。 結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，ARI對(duì)PDGF-B鏈mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯影響。Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，PDGF刺激MsC后15min激活了ERK、JNK、P13K/Akt信號(hào)通路，而p38信號(hào)通路沒(méi)有被活化。若以ARI預(yù)孵育24小

8、時(shí)后再加PDGF刺激，則JNK通路和P13K/Akt通路被明顯抑制，且其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而ERK信號(hào)通路的磷酸化沒(méi)有明顯改變(P>0.05)。 結(jié)論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ARI抑制PDGF--BB促M(fèi)sC增殖作用不是經(jīng)轉(zhuǎn)錄水平來(lái)影響PDGF-BB合成的。PDGF-BB刺激MsC后可激活ERK、JNK及P13K/Akt信號(hào)通路，而ARI能抑制JNK和P13K/Akt信號(hào)通路的磷酸化，從而抑制PDGF-BB促M(fèi)sC增殖

9、作用，但ARI對(duì)ERK通路的活化沒(méi)有明顯抑制作用。說(shuō)明ARI可能是通過(guò)JNK及P13K/Akt這兩條信號(hào)通路發(fā)揮其抑制MsC增殖的作用的，且這一作用與ERK信號(hào)通路無(wú)關(guān)。上述結(jié)果也同時(shí)驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)室的前期工作：AR僅能部分抑制PDGFBB促M(fèi)sC的增殖作用。即ARI不能抑制PDGF-BB促增殖時(shí)引起的所有信號(hào)通路的活化，那么它只能部分而不能完全抑制其促增殖作用。 第三部分 AR影響PDGF-BB促M(fèi)sC增殖作用是否與細(xì)胞周期素依

10、賴(lài)蛋白激酶抑制蛋白p21<'WAF1/Cip1>和p27<'kip1>的調(diào)控有關(guān) 目的 研究ARI對(duì)PDGF-BB引起的p21<'WAF1/Cip1>及p27<'kip1>蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討ARI部分抑制PDGF-BB促增殖的作用機(jī)制。 方法 以Western免疫印跡法檢測(cè)ARI對(duì)PDGF-BB引起的p21<'WAF1/Cip1>及p27<'kip1>蛋白表達(dá)的改變。結(jié)果與對(duì)照組相比，PDGF-B

11、B刺激組p21<'WAF1/Cip1>的蛋白表達(dá)略有上調(diào)，若預(yù)孵育ARI 24小時(shí)再以PDGF-BB刺激12小時(shí)后，p21<'WAF1/Cip1>的表達(dá)上調(diào)則受到明顯抑制，其組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，PDGF--BB刺激組p27<'kip1>的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，若預(yù)孵育ARI則能對(duì)抗該蛋白的下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 PDGF-BB刺激能上調(diào)p21蛋白的表達(dá)，若以ARI預(yù)孵育后再行PDGF-BB刺激，

12、則PDGF-BB對(duì)p21的上調(diào)作用將明顯受到抑制。PDGF-BB刺激可致p27表達(dá)下調(diào)，而預(yù)孵育ARI組p27表達(dá)較單純PDGF組上調(diào)。提示，同是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子的p21和p27被PDGF-BB刺激之后蛋白表達(dá)情況有所不同，且預(yù)孵育ARI對(duì)兩者的影響也各不相同。說(shuō)明p21和p27在此過(guò)程中的作用不同。 1．信號(hào)傳導(dǎo)通路分子ERK、JNK和P13K的抑制劑能明顯抑制PDGF-BB促大鼠MsC的增殖作用，提示PDGF-BB刺激M

13、sC增殖及其調(diào)節(jié)過(guò)程中可能有上述三條信號(hào)通路的參與，醛糖還原酶抑制劑(ARI)可部分抑制PDGF-BB促M(fèi)sC增殖作用也可能與這些信號(hào)通路有關(guān)。 2．ARI可部分抑制PDGF-BB促M(fèi)sC增殖作用可能與JNK和P13K/Akt信號(hào)通路有關(guān)，而與ERK信號(hào)通路無(wú)關(guān)。 3．PDGF-BB刺激MsC后可引起p21蛋白表達(dá)上調(diào)，p27蛋白表達(dá)下調(diào)；若預(yù)孵育ARI時(shí)則p21蛋白表達(dá)受到明顯抑制，而p27蛋白表達(dá)增加。提示p21和p